TXNIP在心肌缺血再灌注中的作用研究.pdf

1、研究背景：
　　心肌缺血后恢復(fù)血流可顯著減輕心肌損傷。然而血管的開通卻會發(fā)生缺血再灌注損傷1,2。進(jìn)一步的研究表明，心肌細(xì)胞的自噬在缺血再灌注損傷中起到重要作用。正常情況下，心臟維持著低水平的自噬。心肌缺血時自噬升高，具有對抗缺血的保護(hù)作用。然而在再灌注期，本應(yīng)下降的自噬卻繼續(xù)升高，損害了心臟功能并促進(jìn)了心肌細(xì)胞損傷和死亡3。缺血再灌注時血流既已恢復(fù)，可自噬因何會繼續(xù)激活升高并損害心肌，其機(jī)制我們?nèi)圆磺宄XNIP，又稱 Trx

2、相互結(jié)合蛋白4-6，在心肌缺血時表達(dá)升高。TXNIP敲除小鼠心肌缺血再灌注時，由于TXNIP的敲除導(dǎo)致細(xì)胞的能量代謝更傾向于無氧糖酵解，避免缺血所導(dǎo)致的線粒體進(jìn)行的無效的氧化磷酸化，生成了更多的ATP7。既往報(bào)道，當(dāng)細(xì)胞缺乏能量時，AMPK激活導(dǎo)致自噬8。既然TXNIP能夠調(diào)控心肌細(xì)胞再灌注時期的能量代謝，且又在此時表達(dá)過度升高，TXNIP是否是心肌缺血再灌注時調(diào)控自噬的分子呢，我們?nèi)圆磺宄?。因此，在后續(xù)實(shí)驗(yàn)中我們圍繞此進(jìn)行了系列實(shí)驗(yàn)，

3、以期證明缺血再灌注時TXNIP增加參與調(diào)控了自噬水平的提高。
　　研究目的：
　　1.觀察過表達(dá)或敲除TXNIP是否影響MI/R后心肌損傷
　　2.研究過表達(dá)或敲除TXNIP是否會影響心肌自噬水平
　　3.闡述TXNIP調(diào)控自噬的具體信號通路
　　研究方法：
　　1觀察過表達(dá)或敲除TXNIP是否影響MI/R后心肌損傷
　　1.1構(gòu)建并鑒定TXNIPfloxed/floxed Myosin6-Cr

4、e小鼠
　　1.2通過心肌點(diǎn)注射腺病毒構(gòu)建過表達(dá)TXNIP的小鼠
　　1.3制備小鼠心肌缺血及心肌缺血再灌注模型
　　用6-0絲線結(jié)扎小鼠左冠狀動脈后，將絲線打活結(jié)造成心肌缺血，缺血40分鐘后打開活結(jié)。分別在缺血40分鐘后、再灌注1.5小時及再灌注3小時后檢測心肌蛋白含量。在缺血40分鐘再灌注3小時后檢測心肌細(xì)胞凋亡，在再灌注24小時后檢測心功能及心肌梗死面積。假手術(shù)組采用同樣的手術(shù)方法，但并不結(jié)扎小鼠冠狀動脈

5、　　1.4通過Western blot檢測心肌細(xì)胞TXNIP表達(dá)
　　1.5通過小動物超聲檢測及左心室內(nèi)插管測定小鼠小鼠心臟功能
　　1.6通過伊文氏藍(lán)/TTC雙染法檢測小鼠心肌缺血再灌注后心肌梗死面積
　　1.7通過TUNEL染色測定小鼠心肌細(xì)胞凋亡
　　2研究過表達(dá)或敲除TXNIP是否會影響心肌自噬水平
　　2.1鑒定 LC3-GFP小鼠，同時構(gòu)建 TXNIPfloxed/floxedMyosin6-C

6、re-LC3-GFP小鼠及LC3-GFP-TXNIP過表達(dá)小鼠
　　2.2制備小鼠心肌缺血及心肌缺血再灌注模型
　　方法同前。分別在缺血40分鐘后及再灌注3小時后檢測心肌蛋白含量。在缺血40分鐘再灌注3小時后使用電鏡及熒光顯微鏡檢測小鼠自噬情況
　　2.3通過Western blot檢測心肌組織LC3及P62的表達(dá)
　　2.4使用透射電鏡觀察心肌自噬小體
　　2.5使用熒光顯微鏡觀察小鼠LC3-GFP自噬小

7、體
　　3闡述TXNIP調(diào)控自噬的具體信號通路
　　3.1鑒定AMPKfloxed/floxedMyosin6-Cre小鼠，構(gòu)建AMPKfloxed/floxedMyosin6-Cre-TXNIP過表達(dá)小鼠
　　3.2制備小鼠心肌缺血及心肌缺血再灌注模型
　　方法同前。分別在缺血40分鐘后及再灌注3小時后檢測心肌蛋白含量及ATP含量。在缺血40分鐘再灌注3小時后使用電鏡檢測小鼠自噬情況
　　3.3通過熒光法

8、測定心肌組織ATP含量
　　3.4通過 Western blot檢測心肌細(xì)胞 pAMPK、AMPK、pRaptor、Raptor、pULK1、ULK1的表達(dá)
　　3.5通過透射電鏡觀察相關(guān)小鼠心肌自噬小體
　　3.6通過Western blot檢測心肌組織LC3表達(dá)
　　研究結(jié)果：
　　1缺血所致的TXNIP升高加重心肌缺血再灌注損傷
　　1.1心肌缺血及再灌注損傷過程中TXNIP持續(xù)升高
　　

9、1.2 TXNIP過表達(dá)加重了小鼠心肌缺血再灌注后的心臟功能降低
　　TXNIP過表達(dá)小鼠顯著加重了心肌缺血再灌注損傷導(dǎo)致的左室射血分?jǐn)?shù)降低。缺血再灌后，TXNIP過表達(dá)小鼠的LVEDP，+dp/dtmax和-dp/dtmax三個指標(biāo)均明顯差于WT小鼠與TXNIP敲除小鼠。而TXNIP敲除小鼠的上述指標(biāo)相比野生小鼠出現(xiàn)進(jìn)一步的好轉(zhuǎn)
　　1.3 TXNIP過表達(dá)增加了缺血再灌注后的心肌梗死面積及細(xì)胞凋亡
　　與野生型小鼠

10、相比，TXNIP過表達(dá)小鼠顯著增加心肌梗死面積及心肌細(xì)胞凋亡，而TXNIP敲除小鼠缺血再灌注損傷則顯著更輕
　　2升高的TXNIP加強(qiáng)了心肌缺血再灌所導(dǎo)致的自噬增加
　　2.1 TXNIP影響了缺血再灌注后心肌自噬相關(guān)蛋白的含量
　　在缺血再灌注后，TXNIP過表達(dá)小鼠的LC3 II/LC3 I的比值進(jìn)一步升高，與野生型小鼠和TXNIP敲除鼠相比均出現(xiàn)統(tǒng)計(jì)學(xué)差異。野生型小鼠與TXNIP敲除鼠的LC3 II/LC3 I的

11、比值亦出現(xiàn)統(tǒng)計(jì)學(xué)差異，敲除鼠的比值顯著更低
　　2.2 TXNIP影響了缺血再灌注后心肌細(xì)胞的自噬小體數(shù)量
　　通過透射電鏡及觀察 LC3-GFP小鼠的心肌細(xì)胞熒光斑點(diǎn)，我們發(fā)現(xiàn)自噬小體水平在TXNIP敲除鼠中顯著降低，而在TXNIP過表達(dá)小鼠中顯著升高
　　3 TXNIP通過AMPK調(diào)控心肌缺血再灌導(dǎo)致的自噬增加
　　3.1 TXNIP影響心肌缺血再灌注后ATP生成
　　與野生型小鼠相比較，TXNIP敲除

12、鼠的ATP含量在缺血再灌注后顯著更高，具有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異，而TXNIP過表達(dá)小鼠的心肌ATP含量出現(xiàn)了顯著的下降
　　3.2 TXNIP通過AMPK調(diào)節(jié)自噬
　　在TXNIP過表達(dá)小鼠中，缺血再灌注導(dǎo)致AMPK、Raptor的磷酸化激活增加，而TXNIP敲除小鼠則可減少AMPK、Raptor的磷酸化激活，增加ULK1的磷酸化失活。進(jìn)一步，在AMPK被敲除后，與具有AMPK活性的野生型小鼠相比，TXNIP過表達(dá)所導(dǎo)致的自噬小體數(shù)量