JAK-STAT信號(hào)通路在施萬(wàn)樣細(xì)胞結(jié)合脫細(xì)胞支架促進(jìn)大鼠坐骨神經(jīng)再生修復(fù)的機(jī)制.pdf

1、目的：
　　周圍神經(jīng)損傷是臨床常見的致殘性疾病，發(fā)病率呈逐年增高的趨勢(shì)。本研究以ADSCs為種子細(xì)胞的源泉，將其在多因子的聯(lián)合作用下誘導(dǎo)分化為施萬(wàn)樣細(xì)胞，以ANA為支架構(gòu)建組織工程神經(jīng)，橋接大鼠缺損的坐骨神經(jīng)，觀察損傷神經(jīng)順向軸漿運(yùn)輸?shù)陌衅鞴佟枘c肌中運(yùn)動(dòng)終板(Motor end plate，MEP)形態(tài)、數(shù)量以及乙酰膽堿酯酶(AchE)的含量;檢測(cè)逆向軸漿運(yùn)輸?shù)陌衅鞴佟顾韬图股窠?jīng)節(jié)中神經(jīng)營(yíng)養(yǎng)因子（BDNF、CNTF和NGF）及

2、JAK/STAT通路中P-JAK2/JAK2和P-STAT3/STAT3的表達(dá)，應(yīng)用JAK抑制劑AG490后，再次檢測(cè)各因子的表達(dá)。從而闡明周圍神經(jīng)再生修復(fù)的分子機(jī)制，完善相關(guān)的理論，為周圍神經(jīng)損傷的臨床康復(fù)治療提供重要的實(shí)驗(yàn)基礎(chǔ)和理論依據(jù)。
　　方法：
　　一、ADSCs的分離、培養(yǎng)和鑒定
　　（一）分離、培養(yǎng)
　　雄性Wistar大鼠，體重100±20 g，無(wú)菌條件下切取附睪旁脂肪組織，酶法消化脂肪組織后進(jìn)行

3、ADSCs培養(yǎng)，待貼壁細(xì)胞約鋪滿瓶底80％時(shí)，進(jìn)行傳代培養(yǎng)。
　　（二）鑒定:選擇第4代ADSCs對(duì)其進(jìn)行鑒定
　　1、采用油紅O和茜素紅染色檢測(cè)ADSCs的多向分化能力。
　　2、采用流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)細(xì)胞表面分子:CD29、CD44、CD49、CD45、CD31及CD106。
　　二、ADSCs誘導(dǎo)分化為施萬(wàn)樣細(xì)胞及施萬(wàn)樣細(xì)胞的鑒定
　　1、取第4代ADSCs，在誘導(dǎo)因子的作用下向SC定向誘導(dǎo)分化。

4、　　2、分別采用免疫熒光、Western Blotting和Real-time PCR從蛋白和基因水平檢測(cè)SC特異性標(biāo)志物GFAP、S-100和P75的表達(dá)。
　　3、采用MTT實(shí)驗(yàn)檢測(cè)施萬(wàn)樣細(xì)胞的增殖能力。
　　三、組織工程神經(jīng)構(gòu)建
　　1、雄性Wistar大鼠，體重200-250 g，10％水合氯醛麻醉大鼠，無(wú)菌條件下切取雙側(cè)坐骨神經(jīng)，長(zhǎng)約為15mm。參照劉承吉等低滲—除垢劑法制備ANA，作為組織工程神經(jīng)的支架。<

5、br>　　2、應(yīng)用PKH-26熒光染料標(biāo)記ADSCs和施萬(wàn)樣細(xì)胞。
　　3、將標(biāo)記后的ADSCs及施萬(wàn)樣細(xì)胞按1×106/ml的接種密度從ANA的一端注入，置于含有相應(yīng)培養(yǎng)基的培養(yǎng)皿中于恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng)72h后備用。
　　四、動(dòng)物分組與坐骨神經(jīng)損傷模型制備及橋接操作
　　1、實(shí)驗(yàn)動(dòng)物分組
　　120只雄性Wistar大鼠（體重200-250 g，購(gòu)自中國(guó)醫(yī)科大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物部）隨機(jī)分為正常對(duì)照組、DMEM組（支架內(nèi)單

6、純注射細(xì)胞培養(yǎng)基）、ADSC組（支架內(nèi)注射ADSCs懸液）、SC組（支架內(nèi)注射施萬(wàn)樣細(xì)胞懸液）和AG組（同SC組，指標(biāo)檢測(cè)前72 h給與AG490進(jìn)行干預(yù)）。
　　2、手術(shù)操作
　　無(wú)菌條件下，各組分別用相應(yīng)的組織工程神經(jīng)橋接于大鼠損傷神經(jīng)的兩斷端處，手術(shù)顯微鏡下端-端縫合神經(jīng)外膜，抗生素沖洗創(chuàng)面，縫合肌肉及皮膚。
　　結(jié)果：
　　一、ADSCs具有干細(xì)胞的特征
　　倒置顯微鏡下觀察ADSCs呈多邊形、長(zhǎng)梭

7、形，團(tuán)簇狀生長(zhǎng)。ADSCs具有成脂和成骨分化能力，并且細(xì)胞表面分子CD29(+)、CD44(+);CD49（-）、CD45（-）、CD31（-）、CD106（-）。以上結(jié)果揭示ADSCs具有干細(xì)胞的特性。
　　二、ADSCs誘導(dǎo)分化為施萬(wàn)樣細(xì)胞并鑒定
　　誘導(dǎo)初期，細(xì)胞體積減小、立體感增強(qiáng)，部分細(xì)胞胞體收縮成梭形，兩側(cè)有對(duì)稱生長(zhǎng)的細(xì)長(zhǎng)突起。10-12 d后胞體繼續(xù)收縮呈梭形，排列成柵欄樣，可見細(xì)長(zhǎng)的突起，且互相吻合成網(wǎng)。We

8、stern Blotting、免疫熒光和Real-time PCR結(jié)果顯示，幾乎所有分化細(xì)胞均表達(dá)GFAP、S100和p75，類似于真正的SC。
　　三、施萬(wàn)樣細(xì)胞具有較強(qiáng)的有絲分裂增殖能力
　　MTT實(shí)驗(yàn)顯示在誘導(dǎo)分化的第1-3 d細(xì)胞生長(zhǎng)緩慢，3d以后細(xì)胞迅速增殖并持續(xù)到第7d，第9-11 d細(xì)胞仍處于增殖狀態(tài)，但增殖速度卻有所下降。同時(shí)，倒置顯微鏡下可見施萬(wàn)樣細(xì)胞的有絲分裂現(xiàn)象。
　　四、PKH-26熒光追蹤AD

9、SCs和施萬(wàn)樣細(xì)胞
　　免疫熒光結(jié)果顯示術(shù)后12 W可見PKH-26標(biāo)記的細(xì)胞發(fā)出紅色熒光信號(hào)，說明ADSCs和施萬(wàn)樣細(xì)胞于術(shù)后12W仍存活于宿主體內(nèi)。
　　五、施萬(wàn)樣細(xì)胞聯(lián)合州A具有明顯促進(jìn)坐骨神經(jīng)功能恢復(fù)的作用
　　（一）神經(jīng)電生理檢測(cè)評(píng)估坐骨神經(jīng)的功能恢復(fù)情況
　　術(shù)后6W，AG組和SC組坐骨神經(jīng)傳導(dǎo)速度和波幅明顯高于DMEM組和ADSC組（P＜0.05）。術(shù)后12W，各組間表達(dá)趨勢(shì)同術(shù)后6W，且AG組神經(jīng)

10、電生理參數(shù)改善程度要優(yōu)于其他組（P＜0.05）。
　　（二）電鏡觀察再生神經(jīng)纖維的超微結(jié)構(gòu)
　　AG組和SC組再生神經(jīng)纖維超微結(jié)構(gòu)明顯優(yōu)于DMEM組和ADSC組，表現(xiàn)為:髓鞘結(jié)構(gòu)較規(guī)整、髓鞘較厚且厚度均一。
　?。ㄈ〢chE染色觀察腓腸肌MEP形態(tài)、數(shù)量及分析AchE光密度值
　　光鏡下，正常對(duì)照組腓腸肌MEP AchE染色呈紅棕色，圓形或橢圓形，著色均勻。術(shù)后6W，AG組和SC組MEP形態(tài)較規(guī)整、數(shù)量以及Ac

11、hE光密度值均明顯高于DMEM組和ADSC組(P＜0.05)。術(shù)后12W，各組間比較趨勢(shì)同術(shù)后6W，且AG組MEP數(shù)量增多，AchE光密度值明顯升高（P＜0.05）。
　　六、施萬(wàn)樣細(xì)胞結(jié)合ANA促進(jìn)坐骨神經(jīng)再生修復(fù)的機(jī)制
　?。ㄒ唬￤estern Blotting檢測(cè)BDNF、CNTF、NGF、JAK2、P-JAK2、STAT3和P-STAT3蛋白的表達(dá)。
　　1、在脊髓
　　(1)術(shù)后6W，AG組和SC組患側(cè)

12、脊髓內(nèi)BDNF、CNTF和NGF蛋白的表達(dá)量明顯高于DMEM組和ADSC組(P＜0.01)，且AG組上述三蛋白表達(dá)量高于SC組(P＜0.01)，接近于正常對(duì)照組(P＞0.05)。術(shù)后12W，各組間BDNF、CNTF和NGF蛋白表達(dá)趨勢(shì)同術(shù)后6W，表達(dá)量高于術(shù)后6W(P＜0.05)。
　　(2)術(shù)后6W，患側(cè)脊髓內(nèi)JAK2蛋白在組間比較差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＞0.05)。而對(duì)于P-JAK2和STAT3/P-STAT3蛋白，AG組和SC

13、組表達(dá)量明顯低于DMEM組和ADSC組(P＜0.01);且AG組低于SC組(P＜0.01)。術(shù)后12W，除外JAK2蛋白在AG組、SC組、DMEM組和ADSC組間比較差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＞0.05); AG組STAT3蛋白的表達(dá)量明顯升高（P＞0.05），其他表達(dá)趨勢(shì)同術(shù)后6W。
　　2、在脊神經(jīng)節(jié)
　　(1)術(shù)后6W，AG組和SC組患側(cè)脊神經(jīng)節(jié)內(nèi)BDNF、CNTF和NGF蛋白的表達(dá)量明顯高于DMEM組和ADSC組(P＜0.

14、01)，低于正常對(duì)照組(P＜0.05);且AG組上述三蛋白表達(dá)量高于SC組(P＜0.01)。術(shù)后12W，除AG組BDNF蛋白表達(dá)量接近于正常對(duì)照組水平外(P＞0.05);其他表達(dá)趨勢(shì)同術(shù)后6W。
　　(2)術(shù)后6W，AG組和SC組患側(cè)脊神經(jīng)節(jié)內(nèi)JAK2和P-JAK2蛋白的表達(dá)量明顯低于DMEM組和ADSC組(P＜0.05);且AG組低于SC組(P＜0.05)。術(shù)后12W，JAK2蛋白表達(dá)在各組間差別無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，P-JAK2蛋白表

15、達(dá)趨勢(shì)同術(shù)后6W。
　?。ǘ┟庖邿晒饣瘜W(xué)染色顯示BDNF、CNTF、NGF、P-JAK2和P-STAT3蛋白的表達(dá)。
　　1、在脊髓
　　(1)術(shù)后6W，AG組和SC組患側(cè)脊髓內(nèi)BDNF、CNTF和NGF蛋白的表達(dá)量明顯高于DMEM組和ADSC組(P＜0.01)，且AG組接近于正常對(duì)照組（P＞0.05）。術(shù)后12W，BDNF、CNTF和NGF蛋白的表達(dá)趨勢(shì)同術(shù)后6W。
　　(2)術(shù)后6W，AG組患側(cè)脊髓內(nèi)P-J

16、AK2和P-STAT3蛋白的表達(dá)量低于DMEM組、ADSC組和SC組(P＜0.05)。術(shù)后12W，除AG組P-JAK2蛋白的表達(dá)量接近于正常對(duì)照組外(P＞0.05)，其他差異趨勢(shì)同術(shù)后6W。
　　2、在脊神經(jīng)節(jié)
　　(1)術(shù)后6W，AG組和SC組患側(cè)脊神經(jīng)節(jié)內(nèi)BDNF、CNTF和NGF蛋白的表達(dá)量明顯高于DMEM組和ADSC組(P＜0.01)，但低于正常對(duì)照組(P＜0.01);且AG組表達(dá)量高于SC組(P＜0.05)。術(shù)后1

17、2W，BDNF、CNTF和NGF蛋白的表達(dá)趨勢(shì)同術(shù)后6W。
　　(2)術(shù)后6W，AG組患側(cè)脊神經(jīng)節(jié)內(nèi)P-JAK2和P-STAT3蛋白的表達(dá)量低于DMEM組、ADSC組和SC組(P＜0.05)，但高于正常對(duì)照組(P＜0.05)。術(shù)后12W，除AG組P-STAT3蛋白的表達(dá)量接近于正常對(duì)照組外(P＞0.05)，其他差異趨勢(shì)同術(shù)后6W。
　　結(jié)論：
　　1、ADSCs能成功誘導(dǎo)分化為施萬(wàn)樣細(xì)胞，表達(dá)SC標(biāo)記物。
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