心房顫動相關(guān)PITX2c基因新突變的識別及功能研究.pdf

1、房顫是臨床上最常見的室上性心律失常。在一般人群中的發(fā)病率約為1-2%，且隨著年齡的增長發(fā)病率逐漸升高，在75歲以上人群中發(fā)病率高達(dá)10%以上。房顫可顯著增加患者的致病率和病死率及經(jīng)濟(jì)負(fù)擔(dān)。房顫多繼發(fā)于冠心病、高血壓、風(fēng)心病等基礎(chǔ)疾病，但特發(fā)性房顫多認(rèn)為與遺傳因素相關(guān)。近年來，已發(fā)現(xiàn)多個與房顫相關(guān)的基因突變，如 KCNQ1、NKX2-5和 TBX5等基因突變據(jù)報道可增加房顫的易感性。
　　目的：本研究旨在識別房顫相關(guān)P IT X2c

2、基因新突變，并對突變基因進(jìn)行功能分析。
　　方法：入選特發(fā)性房顫患者130例及健康對照者200名，獲取臨床資料和外周靜脈血標(biāo)本。使用基因組 DNA純化試劑盒抽提所有入選者的外周血基因組 DNA；以提取的基因組DNA為模板，通過PCR擴(kuò)增P IT X2c基因的所有編碼序列及相鄰的部分內(nèi)含子，通過 DNA測序試劑盒及 DNA測序儀對擴(kuò)增片段進(jìn)行測序，與 GenBank數(shù)據(jù)庫比對以發(fā)現(xiàn) PITX2c基因突變。檢索 P ub Med、S

3、NP等數(shù)據(jù)庫明確所發(fā)現(xiàn)的基因突變的新穎性。通過在線程序 MUS C LE分析新突變氨基酸在物種進(jìn)化上的保守性，通過MutationTaster、PolyPhen-2分析其致病性。應(yīng)用定位誘變PCR獲得突變型 P IT X2c-pc DNA4質(zhì)粒，然后通過脂質(zhì)體轉(zhuǎn)染法轉(zhuǎn)染C HO細(xì)胞，同時轉(zhuǎn)染 ANF(-2600)-Luc表達(dá)質(zhì)粒和內(nèi)對照質(zhì)粒pGL4.75，應(yīng)用雙熒光素酶檢測技術(shù)檢測下游調(diào)控基因 ANF的轉(zhuǎn)錄活性。
　　結(jié)果：在13

4、0例特發(fā)性房顫患者中的1例發(fā)現(xiàn)了1個P IT X2c基因突變，突變率約為0.77％。其編碼核苷酸序列第269位的腺嘌呤變成胸腺嘧啶，稱為 c.269A>T突變，相應(yīng)的第90位的密碼子由AAG變?yōu)?ATG，導(dǎo)致第90位的賴氨酸變?yōu)榈鞍彼?，亦?p. K90M突變，同時該基因突變不存在于200名健康對照者。檢索P ub Med、SNP等數(shù)據(jù)庫未發(fā)現(xiàn)該基因突變，在線程序模擬分析顯示該基因突變在物種進(jìn)化上完全保守、具有致病性。生化分析表明突變型