TRPC3和TRPC6通道在痛覺(jué)信息傳遞和痛覺(jué)敏化中的作用及其作用機(jī)制.pdf

1、疼痛不僅僅被認(rèn)為是一種癥狀，更被看作是一種疾病。近年來(lái)，慢性痛的發(fā)生率逐年增高，越來(lái)越多的人遭受著慢性痛的折磨，生活質(zhì)量和身心健康都受到了嚴(yán)重的危害，痛不欲生。并且慢性痛發(fā)病周期長(zhǎng)，難以治愈，更使得患者對(duì)于慢性痛的治療會(huì)產(chǎn)生巨大的花費(fèi)。長(zhǎng)期遭受慢性痛還會(huì)使患者產(chǎn)生抑郁、恐懼及焦慮等不良情緒，嚴(yán)重危及患者的社交活動(dòng)和人際關(guān)系。對(duì)于慢性痛的研究雖逐步深入，但是慢性痛的治療仍不容樂(lè)觀，臨床上的鎮(zhèn)痛藥還存在很多局限性且特異性不強(qiáng)。因此免除疼痛是

2、患者的權(quán)利，而研究疼痛的發(fā)生發(fā)展機(jī)制，研發(fā)新型的鎮(zhèn)痛良藥，解除疼痛則是我們每一個(gè)疼痛研究者的職責(zé)和目標(biāo)。
　　背根節(jié)（Dorsal root ganglion，DRG）神經(jīng)元在傳遞和加工傷害性信息的過(guò)程中作為痛覺(jué)信息傳導(dǎo)通路中的第一站，起著非常重要的作用，成為產(chǎn)生慢性痛信號(hào)的“起搏點(diǎn)”和“源頭”；持續(xù)不斷的慢性痛信號(hào)經(jīng)過(guò)脊髓背角淺層進(jìn)一步向中樞神經(jīng)元傳遞誘發(fā)中樞敏化，造成痛覺(jué)過(guò)敏和觸誘發(fā)痛，進(jìn)而導(dǎo)致臨床上常見(jiàn)又難以有效治愈的慢性痛

3、。
　　近年來(lái)，越來(lái)越多的實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明瞬時(shí)感受器電位（Transient receptor potential， TRP）通道在痛覺(jué)信息的傳遞過(guò)程中響應(yīng)細(xì)胞及機(jī)體內(nèi)外的傷害性冷、熱、機(jī)械和化學(xué)等刺激，將其轉(zhuǎn)換為動(dòng)作電位向脊髓及上位腦中樞傳遞并最終產(chǎn)生痛感覺(jué)。然而由于特異性工具藥的缺乏，對(duì)經(jīng)典的瞬時(shí)感受器電位（TRPC）通道的研究遠(yuǎn)遠(yuǎn)落后于其他的TRP通道。近年來(lái)，TRPC通道，尤其是TRPC3和TRPC6通道亞型在中樞神經(jīng)系統(tǒng)的定

4、位分布和參與調(diào)節(jié)神經(jīng)生長(zhǎng)、發(fā)育、認(rèn)知、運(yùn)動(dòng)協(xié)調(diào)等功能逐漸被揭示。不僅在中樞神經(jīng)系統(tǒng)中發(fā)現(xiàn)該通道的表達(dá)，TRPC3和TRPC6通道還大量地表達(dá)在痛覺(jué)信息傳導(dǎo)路上，尤其是痛覺(jué)傳導(dǎo)路的第一站DRG的中、小型神經(jīng)元（因其主要負(fù)責(zé)傷害性信息的感受和傳遞又被稱(chēng)為傷害性感受神經(jīng)元或傷害性感受器）。但是TRPC3和TRPC6通道負(fù)責(zé)響應(yīng)機(jī)體內(nèi)外的何種刺激以及在痛覺(jué)信息的傳遞過(guò)程中起著什么樣的作用目前仍是懸而未決。在其他系統(tǒng)中的研究表明TRPC3和TRP

5、C6在結(jié)構(gòu)和功能上具有很大程度的冗余性（redundancy），通常形成功能性的同源或異源四聚體通道，而且其中一個(gè)基因的缺失會(huì)導(dǎo)致另一個(gè)基因代償性地上調(diào)并代償其功能。因此，為了確切闡明TRPC3和TRPC6通道在痛覺(jué)信息傳遞和敏化過(guò)程中的功能作用，我們從海德堡大學(xué)引進(jìn)了TRPC3/TRPC6雙基因敲除（TRPC3 and TRPC6 double knockout，TRPC3/6 DKO）小鼠模型，據(jù)此實(shí)現(xiàn)同時(shí)剔除TRPC3/TRPC6

6、通道的結(jié)構(gòu)和功能，以期揭示TRPC3和TRPC6通道在痛覺(jué)信息傳遞和痛敏形成過(guò)程中的功能意義，為研發(fā)針對(duì)TRPC3和TRPC6通道的新型鎮(zhèn)痛藥提供重要的科學(xué)依據(jù)和理論指導(dǎo)。
　　第一部分：探討TRPC3和TRPC6通道在正常生理狀態(tài)下感受外周感覺(jué)信息的作用及病理情況下的致痛敏作用
　　目的：觀察TRPC3和TRPC6通道在正常生理狀態(tài)下感受外周感覺(jué)信息的作用及病理情況下的致痛敏作用。
　　方法：在正常生理狀態(tài)下檢測(cè)TR

7、PC3/6 DKO小鼠與野生型小鼠對(duì)機(jī)械刺激以及熱刺激反應(yīng)性的差別。小鼠一側(cè)后肢足底皮下注射完全弗氏佐劑（CFA）建立慢性炎性病理性疼痛模型，檢測(cè)造模前和造模后不同時(shí)間點(diǎn)TRPC3/6 DKO小鼠與野生型小鼠對(duì)機(jī)械刺激和熱刺激反應(yīng)性的差別。一側(cè)后肢足底注射炎性介質(zhì)緩激肽，檢測(cè)其誘發(fā)的自發(fā)痛行為反應(yīng)在兩種基因型動(dòng)物之間的差別。采用轉(zhuǎn)軸實(shí)驗(yàn)來(lái)驗(yàn)證TRPC3/6基因敲除后是否會(huì)影響小鼠的運(yùn)動(dòng)協(xié)調(diào)能力。
　　結(jié)果：正常生理狀態(tài)下，對(duì)成年雄

8、性小鼠進(jìn)行機(jī)械痛閾和熱痛閾的檢測(cè)，結(jié)果發(fā)現(xiàn)敲除小鼠對(duì)機(jī)械性刺激和熱刺激的反應(yīng)性較野生型小鼠顯著下降。向小鼠后肢足底皮下注入完全弗氏佐劑（CFA）建立慢性炎性痛模型。實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示野生型小鼠后肢足底皮下注入CFA后呈現(xiàn)顯著的機(jī)械性痛敏和熱痛敏現(xiàn)象，表現(xiàn)為注射足對(duì)機(jī)械刺激的反應(yīng)閾值明顯降低和對(duì)熱刺激的反應(yīng)潛伏期顯著縮短。與野生型小鼠相比，TRPC3/6 DKO小鼠在CFA注射后誘致的機(jī)械性痛敏和熱痛敏程度均顯著減弱。這一結(jié)果提示TRPC3/6

9、通道在CFA誘致的炎性痛過(guò)敏產(chǎn)生過(guò)程中發(fā)揮著重要作用。
　　大量研究結(jié)果顯示炎癥或損傷發(fā)生時(shí)，受損部位的細(xì)胞釋放多種炎癥介質(zhì)如緩激肽（Bradykinin）、組胺（Histamine）、前列腺素（PGE2）、P物質(zhì)（Substance P），降鈣素基因相關(guān)肽（CGRP）等，其與傷害性感受器上的相應(yīng)受體作用最終導(dǎo)致傷害性感受器的閾值降低、反應(yīng)性增強(qiáng)，該過(guò)程被稱(chēng)為“外周敏化（ Peripheral sensitization）”。Br

10、adykinin是損傷、炎癥、缺血后局部組織和細(xì)胞釋放的致痛作用最強(qiáng)的內(nèi)源性炎性介質(zhì)，局部注入Bradykinin可以誘致動(dòng)物出現(xiàn)急性的自發(fā)痛反應(yīng)和長(zhǎng)時(shí)程的機(jī)械和熱痛覺(jué)過(guò)敏現(xiàn)象。我們進(jìn)一步檢測(cè)TRPC3/6通道在組織損傷狀態(tài)下的致痛敏作用是否是由于局部釋放炎性介質(zhì)Bradykinin介導(dǎo)的。為此，我們進(jìn)一步觀察TRPC3/6通道在內(nèi)源性炎性介質(zhì)Bradykinin誘致的痛覺(jué)反應(yīng)中的作用。實(shí)驗(yàn)結(jié)果發(fā)現(xiàn)野生型小鼠后肢足底皮下注入Bradyk

11、inin可誘致顯著的自發(fā)痛行為反應(yīng)，表現(xiàn)為抬足、添足、咬足等痛行為反應(yīng)。定量分析顯示與野生型小鼠相比（83.14?8.26 s），TRPC3/6 DKO小鼠的自發(fā)痛反應(yīng)時(shí)間顯著縮短（44.88?11.3 s）。以上結(jié)果強(qiáng)烈提示TRPC3和TRPC6通道可能在病理狀態(tài)下協(xié)同發(fā)揮著顯著的致痛敏作用。
　　為了進(jìn)一步驗(yàn)證TRPC3/6通道在上述痛行為中的作用是由于對(duì)感覺(jué)功能的特異性作用，我們進(jìn)一步檢測(cè)了TRPC3/6通道對(duì)小鼠運(yùn)動(dòng)協(xié)調(diào)能

12、力的影響。轉(zhuǎn)棒疲勞試驗(yàn)結(jié)果顯示基因敲除小鼠與野生型小鼠從轉(zhuǎn)軸掉落的時(shí)間沒(méi)有顯著差異，提示TRPC3/6通道對(duì)小鼠的運(yùn)動(dòng)協(xié)調(diào)能力沒(méi)有顯著影響。
　　第二部分：TRPC3和TRPC6通道對(duì)DRG傷害性感受神經(jīng)元興奮性的影響
　　目的：探討TRPC3和TRPC6通道對(duì)DRG傷害性感受器興奮性的影響。
　　方法：取正常健康成年小鼠，在正常狀態(tài)下以及建立CFA慢性炎性痛模型24 h后，采用全細(xì)胞膜片鉗記錄技術(shù)比較野生型小鼠和敲除

13、小鼠L4-L5 DRG傷害性感受神經(jīng)元被動(dòng)膜特性和主動(dòng)膜特性之間的差異。
　　結(jié)果：
　　1）我們?nèi)≌＝】党赡晷∈?，采用全?xì)胞膜片鉗記錄技術(shù)在正常生理狀態(tài)下比較野生型小鼠和敲除小鼠L4-L5 DRG傷害性感受神經(jīng)元被動(dòng)膜特性和主動(dòng)膜特性之間的差異。結(jié)果顯示在正常生理情況下，野生型小鼠和敲除小鼠的被動(dòng)膜特性如靜息膜電位（RMP）、膜電阻（Rm）和膜電容（Cm）均無(wú)顯著性差異。通過(guò)向DRG神經(jīng)元內(nèi)注入去極化電流誘致動(dòng)作電位檢測(cè)

14、主動(dòng)膜特性時(shí)發(fā)現(xiàn)，TRPC3/6基因敲除小鼠誘致動(dòng)作電位（action potential，AP）產(chǎn)生所需的基強(qiáng)度（Rheobase）顯著高于野生型小鼠。同時(shí)，注入相同強(qiáng)度的去極化電流誘致AP的發(fā)放頻率也較野生型小鼠顯著降低。這一結(jié)果提示TRPC3和TRPC6通道在決定生理狀態(tài)下DRG傷害性感受神經(jīng)元的興奮性中發(fā)揮著重要的作用。
　　2）同樣采用全細(xì)胞膜片鉗記錄技術(shù)在CFA誘致后24h的病理情況下對(duì)野生型小鼠和敲除小鼠L4-L5

15、DRG傷害性感受神經(jīng)元被動(dòng)膜特性和主動(dòng)膜特性進(jìn)行記錄。結(jié)果發(fā)現(xiàn)在CFA誘致的炎性病理痛狀態(tài)下，野生型小鼠在CFA后與正常狀態(tài)下比較興奮性顯著升高，具體表現(xiàn)在 DRG神經(jīng)元誘致AP的基強(qiáng)度與正常狀態(tài)下相比（88.57±24.73 pA），CFA注射后基強(qiáng)度顯著減?。?0±8.7 pA）。DRG神經(jīng)元AP的頻率與正常狀態(tài)下相比（11.81±3.17 Hz），CFA注射后顯著增強(qiáng)（34.49±2.68 Hz）。而敲除小鼠與野生型小鼠相比，興奮

16、性顯著低于野生型小鼠。上述結(jié)果提示TRPC3和TRPC6通道在決定病理狀態(tài)下的DRG傷害性感受神經(jīng)元的超興奮狀態(tài)中發(fā)揮著關(guān)鍵作用。
　　第三部分： TRPC3和TRPC6通道對(duì)炎性痛情況下脊髓背角c-Fos與p-ERK表達(dá)的影響
　　目的：進(jìn)一步探討TRPC3和TRPC6通道發(fā)揮的致痛敏作用是否是通過(guò)增強(qiáng)脊髓背角痛覺(jué)神經(jīng)元的反應(yīng)性來(lái)實(shí)現(xiàn)的。
　　方法：小鼠后肢足底皮下注射福爾馬林，2 h后灌注、取小鼠腰膨大脊髓、后固定

17、、脫水、行冰凍切片，片厚30?m，采用免疫組化進(jìn)行染色。
　　結(jié)果：實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示福爾馬林誘致的脊髓背角淺層c-Fos與p-ERK的表達(dá)上調(diào)在TRPC3/6 DKO小鼠被顯著削弱。以上結(jié)果提示TRPC3和TRPC6通道在炎性痛情況下對(duì)脊髓背角淺層神經(jīng)元活動(dòng)具有顯著的增強(qiáng)作用。
　　第四部分：TRPC3和TRPC6通道敲除后對(duì)脊髓背角I層神經(jīng)元興奮性突觸傳遞和突觸可塑性的影響
　　目的：進(jìn)一步明確TRPC3和TRPC6通道

18、發(fā)揮致痛敏作用的細(xì)胞和分子機(jī)制。
　　方法：采用生后15-21 d的小鼠，在正常狀態(tài)下以及建立CFA慢性炎性痛模型24 h后，制作脊髓薄片標(biāo)本，對(duì)脊髓背角I層的神經(jīng)元進(jìn)行全細(xì)胞膜片鉗記錄。觀察基因敲除小鼠和野生型小鼠脊髓背角I層神經(jīng)元興奮性的差異以及TRPC3/6通道對(duì)傷害性初級(jí)傳入突觸傳遞效能及可塑性改變的影響。記錄脊髓背角I層神經(jīng)元的被動(dòng)和主動(dòng)膜特性；記錄刺激傷害性初級(jí)傳入纖維在脊髓背角I層神經(jīng)元誘發(fā)的興奮性突觸后電流（eEP

19、SCs），以及脊髓背角I層神經(jīng)元自發(fā)興奮性突觸后電流（sEPSCs）。
　　結(jié)果：
　　1）在正常生理狀態(tài)下，采用不同刺激強(qiáng)度（100?A，300?A，500?A，1mA，2mA，3mA）刺激初級(jí)傳入纖維后根進(jìn)入?yún)^(qū)記錄在脊髓背角I層神經(jīng)元誘發(fā)的eEPSCs。繪制刺激-反應(yīng)曲線（input-output curve, I-O曲線）發(fā)現(xiàn)隨著刺激強(qiáng)度的增大，eEPSCs的幅度也隨之增大。比較eEPSCs的I-O曲線發(fā)現(xiàn)， TRPC

20、3/6 DKO小鼠的I-O曲線呈現(xiàn)明顯右移和下移，即敲除小鼠eEPSCs的幅值明顯低于野生型小鼠。這一結(jié)果提示TRPC3/6通道在脊髓背角的正常興奮性突觸傳遞中發(fā)揮重要作用。
　　2） CFA注射后，野生型小鼠eEPSCs的幅值與正常狀態(tài)下相比呈現(xiàn)顯著增強(qiáng)，表現(xiàn)為I-O曲線較正常狀態(tài)的I-O曲線明顯左移和上移，這一結(jié)果提示炎癥損傷狀態(tài)下，脊髓背角初級(jí)傳入突觸傳遞發(fā)生了顯著的可塑性改變。與野生型小鼠相比，TRPC3/6 DKO小鼠在

21、CFA注射后eEPSCs的可塑性改變被明顯減弱。
　　3）我們同時(shí)還對(duì)炎癥病理情況下TRPC3/6通道對(duì)自發(fā)突觸傳遞的作用進(jìn)行了觀察。經(jīng)對(duì)野生型小鼠和敲除小鼠sEPSCs的頻率和幅值進(jìn)行比較，結(jié)果顯示TRPC3和TRPC6通道敲除后sEPSCs的頻率被顯著地抑制，而幅度沒(méi)有顯著改變。這一結(jié)果提示TRPC3和TRPC6通道對(duì)炎癥損傷情況下脊髓背角I層神經(jīng)元自發(fā)的興奮性突觸傳遞具有顯著的增強(qiáng)效應(yīng)。
　　4）為了進(jìn)一步揭示TRPC

22、3和TRPC6通道對(duì)興奮性突觸傳遞和可塑性改變的作用是突觸前機(jī)制還是突觸后機(jī)制介導(dǎo)的，我們對(duì)炎癥情況下eEPSCs的PPR（paired-pulse ratio）進(jìn)行分析，結(jié)果顯示TRPC3/6基因敲除后eEPSCs的PPF（paired-pulse faciliation）和PPD（paired-pulse depression）均發(fā)生了顯著性改變，該結(jié)果提示TRPC3和TRPC6通道可能是通過(guò)增強(qiáng)初級(jí)傳入纖維終末突觸前遞質(zhì)的釋放機(jī)率

23、來(lái)介導(dǎo)其對(duì)興奮性突觸傳遞和可塑性的影響，進(jìn)而發(fā)揮致痛敏作用。
　　結(jié)論：
　　1．我們利用基因敲除小鼠這一工具，全面揭示了TRPC3和TRPC6通道可能在協(xié)同感受外周的機(jī)械性和熱刺激方面發(fā)揮著重要作用。首次明確提出TRPC3和TRPC6通道在慢性病理性痛中可能發(fā)揮致痛敏作用。
　　2．首次揭示TRPC3和TRPC6可能通過(guò)增強(qiáng)外周敏化介導(dǎo)致痛敏作用的細(xì)胞分子機(jī)制。炎癥或損傷后，外周敏化被認(rèn)為是介導(dǎo)慢性痛發(fā)生發(fā)展的重要神

24、經(jīng)機(jī)制。TRPC3和TRPC6通道在正常狀態(tài)下DRG傷害性感受神經(jīng)元的興奮性以及炎癥損傷誘致的超興奮狀態(tài)中發(fā)揮關(guān)鍵作用。
　　3．首次揭示TRPC3和TRPC6進(jìn)一步通過(guò)增強(qiáng)初級(jí)傳入突觸傳遞及可塑性改變介導(dǎo)致痛敏作用的細(xì)胞分子機(jī)制。炎癥或損傷后，外周敏化和初級(jí)傳入突觸可塑性改變均被認(rèn)為是介導(dǎo)慢性痛發(fā)生發(fā)展的重要神經(jīng)機(jī)制。TRPC3和TRPC6通道敲除后顯著抑制脊髓背角I層神經(jīng)元的eEPSCs及其可塑性增強(qiáng)。PPR和sEPSCs的進(jìn)