TRPC3和TRPC6通道在痛覺信息傳遞和痛覺敏化中的作用及其作用機制.pdf

1、疼痛不僅僅被認為是一種癥狀，更被看作是一種疾病。近年來，慢性痛的發(fā)生率逐年增高，越來越多的人遭受著慢性痛的折磨，生活質(zhì)量和身心健康都受到了嚴重的危害，痛不欲生。并且慢性痛發(fā)病周期長，難以治愈，更使得患者對于慢性痛的治療會產(chǎn)生巨大的花費。長期遭受慢性痛還會使患者產(chǎn)生抑郁、恐懼及焦慮等不良情緒，嚴重危及患者的社交活動和人際關(guān)系。對于慢性痛的研究雖逐步深入，但是慢性痛的治療仍不容樂觀，臨床上的鎮(zhèn)痛藥還存在很多局限性且特異性不強。因此免除疼痛是

2、患者的權(quán)利，而研究疼痛的發(fā)生發(fā)展機制，研發(fā)新型的鎮(zhèn)痛良藥，解除疼痛則是我們每一個疼痛研究者的職責(zé)和目標。
　　背根節(jié)（Dorsal root ganglion，DRG）神經(jīng)元在傳遞和加工傷害性信息的過程中作為痛覺信息傳導(dǎo)通路中的第一站，起著非常重要的作用，成為產(chǎn)生慢性痛信號的“起搏點”和“源頭”；持續(xù)不斷的慢性痛信號經(jīng)過脊髓背角淺層進一步向中樞神經(jīng)元傳遞誘發(fā)中樞敏化，造成痛覺過敏和觸誘發(fā)痛，進而導(dǎo)致臨床上常見又難以有效治愈的慢性痛

3、。
　　近年來，越來越多的實驗結(jié)果表明瞬時感受器電位（Transient receptor potential， TRP）通道在痛覺信息的傳遞過程中響應(yīng)細胞及機體內(nèi)外的傷害性冷、熱、機械和化學(xué)等刺激，將其轉(zhuǎn)換為動作電位向脊髓及上位腦中樞傳遞并最終產(chǎn)生痛感覺。然而由于特異性工具藥的缺乏，對經(jīng)典的瞬時感受器電位（TRPC）通道的研究遠遠落后于其他的TRP通道。近年來，TRPC通道，尤其是TRPC3和TRPC6通道亞型在中樞神經(jīng)系統(tǒng)的定

4、位分布和參與調(diào)節(jié)神經(jīng)生長、發(fā)育、認知、運動協(xié)調(diào)等功能逐漸被揭示。不僅在中樞神經(jīng)系統(tǒng)中發(fā)現(xiàn)該通道的表達，TRPC3和TRPC6通道還大量地表達在痛覺信息傳導(dǎo)路上，尤其是痛覺傳導(dǎo)路的第一站DRG的中、小型神經(jīng)元（因其主要負責(zé)傷害性信息的感受和傳遞又被稱為傷害性感受神經(jīng)元或傷害性感受器）。但是TRPC3和TRPC6通道負責(zé)響應(yīng)機體內(nèi)外的何種刺激以及在痛覺信息的傳遞過程中起著什么樣的作用目前仍是懸而未決。在其他系統(tǒng)中的研究表明TRPC3和TRP

5、C6在結(jié)構(gòu)和功能上具有很大程度的冗余性（redundancy），通常形成功能性的同源或異源四聚體通道，而且其中一個基因的缺失會導(dǎo)致另一個基因代償性地上調(diào)并代償其功能。因此，為了確切闡明TRPC3和TRPC6通道在痛覺信息傳遞和敏化過程中的功能作用，我們從海德堡大學(xué)引進了TRPC3/TRPC6雙基因敲除（TRPC3 and TRPC6 double knockout，TRPC3/6 DKO）小鼠模型，據(jù)此實現(xiàn)同時剔除TRPC3/TRPC6

6、通道的結(jié)構(gòu)和功能，以期揭示TRPC3和TRPC6通道在痛覺信息傳遞和痛敏形成過程中的功能意義，為研發(fā)針對TRPC3和TRPC6通道的新型鎮(zhèn)痛藥提供重要的科學(xué)依據(jù)和理論指導(dǎo)。
　　第一部分：探討TRPC3和TRPC6通道在正常生理狀態(tài)下感受外周感覺信息的作用及病理情況下的致痛敏作用
　　目的：觀察TRPC3和TRPC6通道在正常生理狀態(tài)下感受外周感覺信息的作用及病理情況下的致痛敏作用。
　　方法：在正常生理狀態(tài)下檢測TR

7、PC3/6 DKO小鼠與野生型小鼠對機械刺激以及熱刺激反應(yīng)性的差別。小鼠一側(cè)后肢足底皮下注射完全弗氏佐劑（CFA）建立慢性炎性病理性疼痛模型，檢測造模前和造模后不同時間點TRPC3/6 DKO小鼠與野生型小鼠對機械刺激和熱刺激反應(yīng)性的差別。一側(cè)后肢足底注射炎性介質(zhì)緩激肽，檢測其誘發(fā)的自發(fā)痛行為反應(yīng)在兩種基因型動物之間的差別。采用轉(zhuǎn)軸實驗來驗證TRPC3/6基因敲除后是否會影響小鼠的運動協(xié)調(diào)能力。
　　結(jié)果：正常生理狀態(tài)下，對成年雄

8、性小鼠進行機械痛閾和熱痛閾的檢測，結(jié)果發(fā)現(xiàn)敲除小鼠對機械性刺激和熱刺激的反應(yīng)性較野生型小鼠顯著下降。向小鼠后肢足底皮下注入完全弗氏佐劑（CFA）建立慢性炎性痛模型。實驗結(jié)果顯示野生型小鼠后肢足底皮下注入CFA后呈現(xiàn)顯著的機械性痛敏和熱痛敏現(xiàn)象，表現(xiàn)為注射足對機械刺激的反應(yīng)閾值明顯降低和對熱刺激的反應(yīng)潛伏期顯著縮短。與野生型小鼠相比，TRPC3/6 DKO小鼠在CFA注射后誘致的機械性痛敏和熱痛敏程度均顯著減弱。這一結(jié)果提示TRPC3/6

9、通道在CFA誘致的炎性痛過敏產(chǎn)生過程中發(fā)揮著重要作用。
　　大量研究結(jié)果顯示炎癥或損傷發(fā)生時，受損部位的細胞釋放多種炎癥介質(zhì)如緩激肽（Bradykinin）、組胺（Histamine）、前列腺素（PGE2）、P物質(zhì)（Substance P），降鈣素基因相關(guān)肽（CGRP）等，其與傷害性感受器上的相應(yīng)受體作用最終導(dǎo)致傷害性感受器的閾值降低、反應(yīng)性增強，該過程被稱為“外周敏化（ Peripheral sensitization）”。Br

10、adykinin是損傷、炎癥、缺血后局部組織和細胞釋放的致痛作用最強的內(nèi)源性炎性介質(zhì)，局部注入Bradykinin可以誘致動物出現(xiàn)急性的自發(fā)痛反應(yīng)和長時程的機械和熱痛覺過敏現(xiàn)象。我們進一步檢測TRPC3/6通道在組織損傷狀態(tài)下的致痛敏作用是否是由于局部釋放炎性介質(zhì)Bradykinin介導(dǎo)的。為此，我們進一步觀察TRPC3/6通道在內(nèi)源性炎性介質(zhì)Bradykinin誘致的痛覺反應(yīng)中的作用。實驗結(jié)果發(fā)現(xiàn)野生型小鼠后肢足底皮下注入Bradyk

11、inin可誘致顯著的自發(fā)痛行為反應(yīng)，表現(xiàn)為抬足、添足、咬足等痛行為反應(yīng)。定量分析顯示與野生型小鼠相比（83.14?8.26 s），TRPC3/6 DKO小鼠的自發(fā)痛反應(yīng)時間顯著縮短（44.88?11.3 s）。以上結(jié)果強烈提示TRPC3和TRPC6通道可能在病理狀態(tài)下協(xié)同發(fā)揮著顯著的致痛敏作用。
　　為了進一步驗證TRPC3/6通道在上述痛行為中的作用是由于對感覺功能的特異性作用，我們進一步檢測了TRPC3/6通道對小鼠運動協(xié)調(diào)能

12、力的影響。轉(zhuǎn)棒疲勞試驗結(jié)果顯示基因敲除小鼠與野生型小鼠從轉(zhuǎn)軸掉落的時間沒有顯著差異，提示TRPC3/6通道對小鼠的運動協(xié)調(diào)能力沒有顯著影響。
　　第二部分：TRPC3和TRPC6通道對DRG傷害性感受神經(jīng)元興奮性的影響
　　目的：探討TRPC3和TRPC6通道對DRG傷害性感受器興奮性的影響。
　　方法：取正常健康成年小鼠，在正常狀態(tài)下以及建立CFA慢性炎性痛模型24 h后，采用全細胞膜片鉗記錄技術(shù)比較野生型小鼠和敲除

13、小鼠L4-L5 DRG傷害性感受神經(jīng)元被動膜特性和主動膜特性之間的差異。
　　結(jié)果：
　　1）我們?nèi)≌＝】党赡晷∈?，采用全細胞膜片鉗記錄技術(shù)在正常生理狀態(tài)下比較野生型小鼠和敲除小鼠L4-L5 DRG傷害性感受神經(jīng)元被動膜特性和主動膜特性之間的差異。結(jié)果顯示在正常生理情況下，野生型小鼠和敲除小鼠的被動膜特性如靜息膜電位（RMP）、膜電阻（Rm）和膜電容（Cm）均無顯著性差異。通過向DRG神經(jīng)元內(nèi)注入去極化電流誘致動作電位檢測

14、主動膜特性時發(fā)現(xiàn)，TRPC3/6基因敲除小鼠誘致動作電位（action potential，AP）產(chǎn)生所需的基強度（Rheobase）顯著高于野生型小鼠。同時，注入相同強度的去極化電流誘致AP的發(fā)放頻率也較野生型小鼠顯著降低。這一結(jié)果提示TRPC3和TRPC6通道在決定生理狀態(tài)下DRG傷害性感受神經(jīng)元的興奮性中發(fā)揮著重要的作用。
　　2）同樣采用全細胞膜片鉗記錄技術(shù)在CFA誘致后24h的病理情況下對野生型小鼠和敲除小鼠L4-L5

15、DRG傷害性感受神經(jīng)元被動膜特性和主動膜特性進行記錄。結(jié)果發(fā)現(xiàn)在CFA誘致的炎性病理痛狀態(tài)下，野生型小鼠在CFA后與正常狀態(tài)下比較興奮性顯著升高，具體表現(xiàn)在 DRG神經(jīng)元誘致AP的基強度與正常狀態(tài)下相比（88.57±24.73 pA），CFA注射后基強度顯著減小（30±8.7 pA）。DRG神經(jīng)元AP的頻率與正常狀態(tài)下相比（11.81±3.17 Hz），CFA注射后顯著增強（34.49±2.68 Hz）。而敲除小鼠與野生型小鼠相比，興奮

16、性顯著低于野生型小鼠。上述結(jié)果提示TRPC3和TRPC6通道在決定病理狀態(tài)下的DRG傷害性感受神經(jīng)元的超興奮狀態(tài)中發(fā)揮著關(guān)鍵作用。
　　第三部分： TRPC3和TRPC6通道對炎性痛情況下脊髓背角c-Fos與p-ERK表達的影響
　　目的：進一步探討TRPC3和TRPC6通道發(fā)揮的致痛敏作用是否是通過增強脊髓背角痛覺神經(jīng)元的反應(yīng)性來實現(xiàn)的。
　　方法：小鼠后肢足底皮下注射福爾馬林，2 h后灌注、取小鼠腰膨大脊髓、后固定

17、、脫水、行冰凍切片，片厚30?m，采用免疫組化進行染色。
　　結(jié)果：實驗結(jié)果顯示福爾馬林誘致的脊髓背角淺層c-Fos與p-ERK的表達上調(diào)在TRPC3/6 DKO小鼠被顯著削弱。以上結(jié)果提示TRPC3和TRPC6通道在炎性痛情況下對脊髓背角淺層神經(jīng)元活動具有顯著的增強作用。
　　第四部分：TRPC3和TRPC6通道敲除后對脊髓背角I層神經(jīng)元興奮性突觸傳遞和突觸可塑性的影響
　　目的：進一步明確TRPC3和TRPC6通道

18、發(fā)揮致痛敏作用的細胞和分子機制。
　　方法：采用生后15-21 d的小鼠，在正常狀態(tài)下以及建立CFA慢性炎性痛模型24 h后，制作脊髓薄片標本，對脊髓背角I層的神經(jīng)元進行全細胞膜片鉗記錄。觀察基因敲除小鼠和野生型小鼠脊髓背角I層神經(jīng)元興奮性的差異以及TRPC3/6通道對傷害性初級傳入突觸傳遞效能及可塑性改變的影響。記錄脊髓背角I層神經(jīng)元的被動和主動膜特性；記錄刺激傷害性初級傳入纖維在脊髓背角I層神經(jīng)元誘發(fā)的興奮性突觸后電流（eEP

19、SCs），以及脊髓背角I層神經(jīng)元自發(fā)興奮性突觸后電流（sEPSCs）。
　　結(jié)果：
　　1）在正常生理狀態(tài)下，采用不同刺激強度（100?A，300?A，500?A，1mA，2mA，3mA）刺激初級傳入纖維后根進入?yún)^(qū)記錄在脊髓背角I層神經(jīng)元誘發(fā)的eEPSCs。繪制刺激-反應(yīng)曲線（input-output curve, I-O曲線）發(fā)現(xiàn)隨著刺激強度的增大，eEPSCs的幅度也隨之增大。比較eEPSCs的I-O曲線發(fā)現(xiàn)， TRPC

20、3/6 DKO小鼠的I-O曲線呈現(xiàn)明顯右移和下移，即敲除小鼠eEPSCs的幅值明顯低于野生型小鼠。這一結(jié)果提示TRPC3/6通道在脊髓背角的正常興奮性突觸傳遞中發(fā)揮重要作用。
　　2） CFA注射后，野生型小鼠eEPSCs的幅值與正常狀態(tài)下相比呈現(xiàn)顯著增強，表現(xiàn)為I-O曲線較正常狀態(tài)的I-O曲線明顯左移和上移，這一結(jié)果提示炎癥損傷狀態(tài)下，脊髓背角初級傳入突觸傳遞發(fā)生了顯著的可塑性改變。與野生型小鼠相比，TRPC3/6 DKO小鼠在

21、CFA注射后eEPSCs的可塑性改變被明顯減弱。
　　3）我們同時還對炎癥病理情況下TRPC3/6通道對自發(fā)突觸傳遞的作用進行了觀察。經(jīng)對野生型小鼠和敲除小鼠sEPSCs的頻率和幅值進行比較，結(jié)果顯示TRPC3和TRPC6通道敲除后sEPSCs的頻率被顯著地抑制，而幅度沒有顯著改變。這一結(jié)果提示TRPC3和TRPC6通道對炎癥損傷情況下脊髓背角I層神經(jīng)元自發(fā)的興奮性突觸傳遞具有顯著的增強效應(yīng)。
　　4）為了進一步揭示TRPC

22、3和TRPC6通道對興奮性突觸傳遞和可塑性改變的作用是突觸前機制還是突觸后機制介導(dǎo)的，我們對炎癥情況下eEPSCs的PPR（paired-pulse ratio）進行分析，結(jié)果顯示TRPC3/6基因敲除后eEPSCs的PPF（paired-pulse faciliation）和PPD（paired-pulse depression）均發(fā)生了顯著性改變，該結(jié)果提示TRPC3和TRPC6通道可能是通過增強初級傳入纖維終末突觸前遞質(zhì)的釋放機率

23、來介導(dǎo)其對興奮性突觸傳遞和可塑性的影響，進而發(fā)揮致痛敏作用。
　　結(jié)論：
　　1．我們利用基因敲除小鼠這一工具，全面揭示了TRPC3和TRPC6通道可能在協(xié)同感受外周的機械性和熱刺激方面發(fā)揮著重要作用。首次明確提出TRPC3和TRPC6通道在慢性病理性痛中可能發(fā)揮致痛敏作用。
　　2．首次揭示TRPC3和TRPC6可能通過增強外周敏化介導(dǎo)致痛敏作用的細胞分子機制。炎癥或損傷后，外周敏化被認為是介導(dǎo)慢性痛發(fā)生發(fā)展的重要神

24、經(jīng)機制。TRPC3和TRPC6通道在正常狀態(tài)下DRG傷害性感受神經(jīng)元的興奮性以及炎癥損傷誘致的超興奮狀態(tài)中發(fā)揮關(guān)鍵作用。
　　3．首次揭示TRPC3和TRPC6進一步通過增強初級傳入突觸傳遞及可塑性改變介導(dǎo)致痛敏作用的細胞分子機制。炎癥或損傷后，外周敏化和初級傳入突觸可塑性改變均被認為是介導(dǎo)慢性痛發(fā)生發(fā)展的重要神經(jīng)機制。TRPC3和TRPC6通道敲除后顯著抑制脊髓背角I層神經(jīng)元的eEPSCs及其可塑性增強。PPR和sEPSCs的進