TRPC3-6-7通道在小鼠局灶性腦缺血再灌注損傷中的作用.pdf

1、腦卒中是一類嚴(yán)重危害人類生命健康的疾病，在中樞神經(jīng)系統(tǒng)疾病中具有極高的病死率和致殘率。腦卒中的預(yù)防和治療方法主要有降脂、降壓、溶栓、抗凝、介入、手術(shù)微創(chuàng)治療等，這些方法改善了患者的預(yù)后，但仍有75％的患者因病情反復(fù)而導(dǎo)致不同程度的后遺癥。臨床上約30%的缺血性腦卒中患者由于溶栓治療，會(huì)出現(xiàn)血管再通現(xiàn)象，并伴隨著缺血再灌注損傷。缺血再灌注損傷的病理生理機(jī)制很復(fù)雜，包括：鈣超載、自由基生成增多、能量代謝障礙、興奮性毒性、炎癥和凋亡等，其中

2、Ca2＋超載是腦缺血再灌注損傷的重要機(jī)制之一。因此，針對(duì)這一靶點(diǎn)研究，將有利于深入闡明腦卒中的病理生理機(jī)制，并為治療該疾病提供理論依據(jù)。
　　瞬時(shí)受體電位（TRP）離子通道超家族最早在果蠅的突變體中被發(fā)現(xiàn)?；诎被嵝蛄械耐葱?，TRP超家族可劃分為TRPA，TRPC，TRPM，TRPML，TRPP， TRPV和TRPN7個(gè)亞家族，廣泛表達(dá)于從酵母到人類的各種生物體。其中經(jīng)典瞬時(shí)受體電位（TRPC）是最經(jīng)典的TRP通道， TRPC

3、共有7個(gè)亞型，其中TRPC1/TRPC4/TRPC5相互之間可形成異源通道，而TRPC3/TRPC6/TRPC7之間也能相互形成異源通道。
　　據(jù)報(bào)道，TRPC通道的功能異?？蓪?dǎo)致很多疾病的發(fā)生，因此TRPC通道有望成為藥物治療的靶點(diǎn)。TRPC通道與腦卒中的相關(guān)性研究大多關(guān)注神經(jīng)元，腦卒中后調(diào)節(jié)星形膠質(zhì)細(xì)胞的功能有益于神經(jīng)元的存活。TRPC通道（TRPC1-6）在培養(yǎng)的星形膠質(zhì)細(xì)胞中均有表達(dá)，其中TRPC3、TRPC6與腦卒中密切

4、相關(guān)。因此，本實(shí)驗(yàn)主要研究 TRPC3/6/7通道在腦缺血再灌注損傷中的作用及機(jī)制，并關(guān)注星形膠質(zhì)細(xì)胞在腦缺血再灌注損傷中的作用，為腦卒中的治療提供新的策略。
　　本實(shí)驗(yàn)采用野生型（Wild-type，WT）小鼠與TRPC3/6/7基因敲除（TRPC3/6/7 knockout, TRPC3/6/7-/-）小鼠制備大腦中動(dòng)脈閉塞（Middle Cerebral Artery Occlusion, MCAO）所致的局灶性腦缺血再灌注

5、模型，觀察 TRPC3/6/7基因敲除對(duì)腦缺血再灌注急性期神經(jīng)損傷的影響。采用 Western blot法檢測(cè)小鼠大腦皮層 pNF-кB、Bcl-2、Bax蛋白含量。結(jié)果顯示，TRPC3/6/7基因敲除后，鼠局灶性腦缺血再灌注急性期的神經(jīng)損傷減輕，小鼠大腦皮層缺血區(qū)pNF-кB、Bax水平降低（P<0.05）， Bcl-2水平明顯升高（P<0.05），從而增高Bcl-2/Bax的比值，抑制凋亡的發(fā)生。
　　采用WT小鼠與TRPC3

6、/6/7基因敲除小鼠原代培養(yǎng)的星形膠質(zhì)細(xì)胞制備氧糖剝奪/復(fù)糖復(fù)氧（oxygen-glucose deprivation/reperfusion, OGD/R）模型，觀察TRPC3/6/7基因敲除對(duì)星形膠質(zhì)細(xì)胞氧糖剝奪的影響，采用Western blot法檢測(cè)星形膠質(zhì)細(xì)胞Bcl-2、Bax蛋白表達(dá)。結(jié)果顯示，TRPC3/6/7基因敲除后，鼠OGD/R狀態(tài)下的星形膠質(zhì)細(xì)胞pNF-кB的表達(dá)減少，促凋亡蛋白Bax的表達(dá)下降，抗凋亡蛋白Bcl-

7、2的表達(dá)增加，增高Bcl-2/Bax比值，提示TRPC3/6/7基因敲除后，鼠OGD/R狀態(tài)下的星形膠質(zhì)細(xì)胞的凋亡減少。
　　采用 WT小鼠與 TRPC3/6/7基因敲除小鼠原代培養(yǎng)的星形膠質(zhì)細(xì)胞制備OGD/R模型，鈣影像技術(shù)觀察TRPC3/6/7基因敲除對(duì)OGD/R下星形膠質(zhì)細(xì)胞鈣內(nèi)流的影響，鈣影像結(jié)果顯示，TRPC3/6/7基因敲除的星形膠質(zhì)細(xì)胞經(jīng)OGD/R處理后，Tg刺激引起的鈣內(nèi)流較WT星膠OGD/R組而言，明顯降低（P<

8、0.01）。
　　因此，TRPC3/6/7基因敲除能夠抑制鈣超載引起的腦缺血再灌注損傷，降低Ca2＋超載在腦缺血再灌注腦損傷中的作用。并且細(xì)胞質(zhì) Ca2＋濃度的升高可能激活NF-кB途徑，導(dǎo)致了星形膠質(zhì)細(xì)胞pNF-кB水平的升高，因此TRPC3/6/7基因敲除抑制星形膠質(zhì)細(xì)胞內(nèi)Ca2＋濃度的升高，能夠降低MCAO小鼠大腦皮層pNF-кB蛋白水平，并且能夠下調(diào)促凋亡蛋白Bax的表達(dá)，上調(diào)抗凋亡蛋白Bcl-2的表達(dá)，提示TRPC3/6