TRPC6在氣道炎癥反應(yīng)中的作用及機(jī)制.pdf

1、目的：支氣管哮喘和慢性阻塞性肺病(chronic obstructive pulmonary disease，COPD)的病理生理過程中都伴有氣道炎癥反應(yīng)，但它們的發(fā)病機(jī)制目前尚未闡明，可能與細(xì)胞內(nèi)鈣穩(wěn)態(tài)失衡有關(guān)。瞬時(shí)受體電位（transient receptorpotential，TRP）基因編碼一種通透鈣離子（Ca2+）的陽離子通道。TRPC通道是TRP家族重要成員，是目前離子通道領(lǐng)域研究的熱點(diǎn)之一。TRPC包括TRPC1-7，研究

2、提示[1,2]，TRPC可能在氣道炎癥反應(yīng)中起重要作用，但是TRPC在氣道炎癥反應(yīng)中的具體作用及機(jī)制目前尚無報(bào)道。本課題探究了TRPC在慢性哮喘小鼠肺組織中的表達(dá)以及TRPC6在氣道上皮細(xì)胞炎癥反應(yīng)中的作用及機(jī)制，將有助于闡明氣道炎癥反應(yīng)的分子機(jī)制，為炎癥性疾病的臨床藥物治療提供新的靶點(diǎn)。
　　方法：（1）隨機(jī)將BALB/c小鼠分成對照組和哮喘組。應(yīng)用5％卵白蛋白（ovalbumin，OVA）腹腔注射致敏和霧化激發(fā)的方法制備小鼠慢

3、性哮喘模型，對照組用生理鹽水代替OVA，從氣道反應(yīng)性、支氣管肺泡灌洗液（bronchial alveolar lavage fluid，BALF）中白細(xì)胞計(jì)數(shù)與分類、肺組織的病理變化三方面證實(shí)哮喘模型建立成功。RT-PCR法檢測小鼠肺組織TRPC mRNA和免疫組織化學(xué)染色法觀察肺組織TRPC1、TRPC6與細(xì)胞核轉(zhuǎn)錄因子κB（nuclear factorκB，NF-κB）的蛋白表達(dá)水平的變化。（2）細(xì)胞水平上：①采用RT-PCR、We

4、stern blot和免疫熒光化學(xué)法檢測TRPC6 mRNA和蛋白在人氣道上皮細(xì)胞株（16HBE）的表達(dá)情況。②使用不同劑量的TRPC6高選擇性激動(dòng)劑Hyp9和siRNA以改變TRPC6的功能或表達(dá)后，RT-PCR和ELISA法檢測16HBE細(xì)胞炎癥因子IL-8、IL-6 mRNA表達(dá)和蛋白分泌情況。③采用1μg/ml的LPS分別作用于培養(yǎng)的16HBE細(xì)胞0h、0.5h、2h、6h、12h、24h，應(yīng)用RT-PCR和Western bl

5、ot法檢測LPS對TRPC6的影響，以及RT-PCR和ELISA法檢測炎癥因子IL-8、IL-6的mRNA表達(dá)和蛋白分泌情況。為了進(jìn)一步了解TRPC6的表達(dá)上調(diào)與LPS誘導(dǎo)16HBE細(xì)胞炎癥反應(yīng)的關(guān)系，本課題使用TRPC6特異性激動(dòng)劑Hyp9(10μM)和siRNA以改變TRPC6的功能或表達(dá)后，應(yīng)用RT-PCR和ELISA法觀察LPS誘導(dǎo)的炎癥反應(yīng)的變化。④用RT-PCR和ELISA法分別檢測不同劑量的TLR4特異性抑制劑CLI-09

6、5對LPS(1μg/ml)誘導(dǎo)16HBE炎癥因子IL-8、IL-6mRNA表達(dá)和蛋白分泌的影響；并用RT-PCR、Western blot法分別檢測CLI-095(5μM)對LPS(1μg/ml)誘導(dǎo)16HBE細(xì)胞TRPC6 mRNA和蛋白表達(dá)的影響。⑤LPS(1μg/ml)分別處理16HBE細(xì)胞0h、0.5h、2h、6h、12h、24h后，RT-PCR、Western blot、免疫熒光化學(xué)法分別檢測16HBE細(xì)胞NF-κB P65m

7、RNA、蛋白表達(dá)與核轉(zhuǎn)位的情況；并用RT-PCR、Western blot、免疫熒光化學(xué)法分別檢測CLI-095(5μM)對LPS(1μg/ml)誘導(dǎo)16HBE細(xì)胞NF-κB P65 mRNA和蛋白表達(dá)以及核轉(zhuǎn)位的影響；通過Hyp9(10μM)激活TRPC6通道和siRNA沉默TRPC6基因，應(yīng)用RT-PCR、Western blot、免疫熒光化學(xué)法進(jìn)一步證實(shí)NF-κB介導(dǎo)TRPC6的致炎癥作用。
　　結(jié)果：（1）RT-PCR結(jié)果

8、顯示，正常小鼠肺組織表達(dá)TRPC1、TRPC2、TRPC3、TRPC6 mRNA，而慢性哮喘小鼠肺組織TRPC1和TRPC6 mRNA表達(dá)顯著增高；免疫組化實(shí)驗(yàn)進(jìn)一步觀察到，哮喘小鼠肺組織的氣道上皮細(xì)胞和浸潤的炎癥細(xì)胞中TRPC1、TRPC6和NF-κB P65蛋白表達(dá)顯著增高，相關(guān)性分析顯示，TRPC1和TRPC6蛋白的表達(dá)水平均與氣道反應(yīng)性、白細(xì)胞總數(shù)、嗜酸性粒細(xì)胞以及NF-κB P65蛋白的表達(dá)水平顯著相關(guān)，NF-κB P65蛋白

9、的表達(dá)水平也與氣道反應(yīng)性、白細(xì)胞總數(shù)以及嗜酸性粒細(xì)胞顯著相關(guān)。（2）細(xì)胞水平上，①RT-PCR結(jié)果表明，TRPC6 mRNA在16HBE細(xì)胞上有表達(dá)；Western blot和免疫熒光化學(xué)法結(jié)果進(jìn)一步表明，TRPC6蛋白不僅有表達(dá)，而且主要定位于細(xì)胞膜上。②Hyp9開放TRPC6通道后16HBE細(xì)胞的炎癥反應(yīng)明顯增強(qiáng)，表現(xiàn)為IL-8和IL-6 mRNA表達(dá)和蛋白分泌增加。而基因沉默TRPC6后Hyp9的致炎效應(yīng)被明顯消弱，這更進(jìn)一步證實(shí)

10、了Hyp9的致炎效應(yīng)是依賴TRPC6而實(shí)現(xiàn)的。③LPS處理16HBE細(xì)胞后，應(yīng)用RT-PCR和Western blot檢測LPS對TRPC6表達(dá)的影響，結(jié)果顯示，LPS作用2h后TRPC6 mRNA和蛋白表達(dá)開始增高，一直持續(xù)到24h。與此同時(shí)，IL-8 mRNA表達(dá)和蛋白分泌6h開始增高，持續(xù)到24h；而IL-6 mRNA表達(dá)2h開始增高，6h后蛋白分泌才開始增高，亦持續(xù)到24h。結(jié)果表明，LPS可誘導(dǎo)16HBE細(xì)胞發(fā)生炎癥反應(yīng)，且這

11、種炎癥反應(yīng)可能與TRPC6的表達(dá)增加有關(guān)。進(jìn)一步研究顯示，LPS和Hyp9均使16HBE細(xì)胞中IL-8和IL-6mRNA表達(dá)和蛋白分泌增加；Hyp9能使LPS誘導(dǎo)16HBE細(xì)胞炎癥反應(yīng)進(jìn)一步增強(qiáng)。而TRPC6 siRNA能抑制LPS誘導(dǎo)16HBE細(xì)胞炎癥反應(yīng)，進(jìn)一步證實(shí)TRPC6可介導(dǎo)LPS誘導(dǎo)的氣道上皮細(xì)胞炎癥反應(yīng)。④TLR4的特異性抑制劑CLI-095呈劑量依賴性抑制LPS誘導(dǎo)的細(xì)胞因子IL-8和IL-6的mRNA表達(dá)和蛋白分泌，其

12、中1μM CLI-095即可發(fā)揮顯著抑制效應(yīng)，5μMCLI-095抑制效應(yīng)更為明顯。同時(shí)，5μM CLI-095也能抑制LPS誘導(dǎo)的16HBE細(xì)胞TRPC6 mRNA和蛋白表達(dá)。這些結(jié)果表明，LPS是通過TLR4上調(diào)TRPC6的表達(dá)并引起炎癥反應(yīng)。⑤LPS(1μg/ml)作用16HBE細(xì)胞6h后，NF-κB P65 mRNA和蛋白表達(dá)開始增高，持續(xù)到24h；核轉(zhuǎn)位現(xiàn)象2h后逐漸出現(xiàn)，隨著時(shí)間的延長，核轉(zhuǎn)位的蛋白越來越多。進(jìn)一步的實(shí)驗(yàn)表明

13、TLR4的抑制劑CLI-095可以抑制LPS誘導(dǎo)的16HBE細(xì)胞中NF-κB P65表達(dá)上調(diào)以及核轉(zhuǎn)位。另外，LPS和Hyp9均使NF-κB P65 mRNA和蛋白表達(dá)增加以及蛋白核轉(zhuǎn)位，而LPS和Hyp9的共同作用與單獨(dú)的LPS或Hyp9相比，NF-κB P65mRNA和蛋白表達(dá)以及蛋白核轉(zhuǎn)位現(xiàn)象更為明顯。而TRPC6 siRNA則抑制LPS誘導(dǎo)的16HBE細(xì)胞NF-κB P65蛋白表達(dá)。以上結(jié)果表明，NF-κB可介導(dǎo)TLR4/TRP

14、C6通路的致炎癥作用。
　　結(jié)論：（1）正常小鼠肺組織上有TRPC1、TRPC2、TRPC3和TRPC6 mRNA表達(dá)；人氣道上皮細(xì)胞株16HBE上有TRPC6 mRNA和蛋白的表達(dá)，而且蛋白主要定位在細(xì)胞膜上。（2）慢性哮喘小鼠肺組織的TRPC1和TRPC6 mRNA和蛋白表達(dá)水平顯著增高，與氣道炎癥呈顯著相關(guān)。（3）在細(xì)胞水平上證實(shí)TLR4/TRPC6/NF-κB信號轉(zhuǎn)導(dǎo)通路介導(dǎo)氣道上皮細(xì)胞炎癥反應(yīng)。綜上所述，本研究發(fā)現(xiàn)了 T