TRPC6介導(dǎo)BDNF通路在糖尿病大鼠神經(jīng)病理性痛發(fā)生中的作用及其機(jī)制研究.pdf

1、目的：流行病學(xué)表明，約60％糖尿病患者并發(fā)糖尿病神經(jīng)病變，以糖尿病神經(jīng)病理性痛(Diabetic Neuropathic Pain，DNP)最為常見(jiàn)。DNP是臨床最常見(jiàn)的神經(jīng)病理性疼痛類型之一，可出現(xiàn)自發(fā)痛、痛覺(jué)過(guò)敏、觸誘發(fā)痛和其他不典型感覺(jué)異常，嚴(yán)重影響患者生活質(zhì)量。理想的治療方法和藥物開(kāi)發(fā)依賴于對(duì)DNP發(fā)生機(jī)制的認(rèn)識(shí)。研究表明，腦源性神經(jīng)營(yíng)養(yǎng)因子(Brain Derived Neurophic Factor, BDNF)/TrkB系

2、統(tǒng)及其對(duì)胞內(nèi)Ca2+濃度的調(diào)節(jié)參與不同原因所致的痛覺(jué)過(guò)敏的形成和發(fā)展，但詳細(xì)機(jī)制仍不清楚。我們的預(yù)實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，在DNP大鼠中，經(jīng)典瞬時(shí)受體電位離子通道6(TRPC6)對(duì)機(jī)械性痛敏發(fā)揮調(diào)節(jié)作用，這種作用也可能和DRG神經(jīng)元內(nèi)Ca2+濃度改變密切相關(guān)。因此，我們提出并探討TRPC6介導(dǎo)BDNF通路對(duì)神經(jīng)元內(nèi)Ca2+濃度調(diào)節(jié)，參與DNP大鼠機(jī)械性痛敏形成的作用和可能機(jī)制。
　　方法：應(yīng)用Von Frey細(xì)絲測(cè)量大鼠機(jī)械性痛覺(jué)閾值;應(yīng)用免疫

3、熒光技術(shù)檢測(cè)脊髓和背根神經(jīng)節(jié)中BDNF和TRPC6的表達(dá);應(yīng)用Western blot技術(shù)檢測(cè)大鼠脊髓和背根神經(jīng)節(jié)BDNF和TRPC6的表達(dá);運(yùn)用鈣離子成像技術(shù)檢測(cè)大鼠DRG神經(jīng)元中Ca2+濃度的變化。
　　結(jié)果：1 STZ誘導(dǎo)DNP模型大鼠機(jī)械性痛覺(jué)閾值在注射STZ(60mg/kg)后逐漸降低，與正常對(duì)照組相比，21天左右降幅最大(P＜0.001)。Western blot結(jié)果顯示，分別在注射STZ后第7天，14天，21天和28

4、天取材的DRG和脊髓中，與正常對(duì)照組大鼠相比，BDNF和TRPC6蛋白表達(dá)增加，與正常對(duì)照組相比，21天達(dá)到峰值(P＜0.01)。免疫熒光結(jié)果表明在DNP模型大鼠的DRG神經(jīng)元和脊髓背角淺層中BDNF和TRPC6表達(dá)均較正常對(duì)照組增加(P＜0.05)。2鞘內(nèi)注射酪氨酸激酶受體抑制劑K252a(200ng/10ul)和扣壓BDNF的TrkB-Fc(200ng/10ul)分別非特異和特異性抑制BDNF通路，DNP大鼠的機(jī)械性痛覺(jué)閾值較DNP

5、+溶媒組明顯升高(P＜0.01)，正常大鼠閾值無(wú)明顯變化。鞘內(nèi)注射非選擇性牽張激活陽(yáng)離子通道抑制劑GsMTX-4(100ng/10ul)和TRPC通道抑制劑BTP2(5ug/10ul)非特異抑制TRPC6通道后，DNP大鼠的機(jī)械性痛覺(jué)閾值較DNP+溶媒組升高(P＜0.05)，正常大鼠閾值無(wú)明顯變化。鞘內(nèi)注射TRPC6的反義寡核酸AS ODN(10ng/10ul/天，X3天)，特異性抑制TRPC6通道，DNP大鼠的機(jī)械性痛覺(jué)閾值較DNP+

6、MM組顯著升高(P＜0.05)，正常大鼠閾值無(wú)明顯變化，同時(shí)Western blot結(jié)果顯示在正常和DNP大鼠的DRG和脊髓中，反義寡核酸敲除TRPC6后，TRPC6的表達(dá)均減少(P＜0.05)。3正常大鼠鞘內(nèi)注射TRPC6的AS ODN(10ng/10ul/天，X3天)抑制TRPC6后再鞘內(nèi)給予BDNF(20ng/10ul)，大鼠機(jī)械性痛覺(jué)閾值較Control+AS+PBS組明顯降低(P＜0.05)，而在DNP大鼠DNP+AS+BDN

7、F組和DNP+AS+PBS組機(jī)械性痛覺(jué)閾值則均明顯升高，差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05）。4鈣離子成像技術(shù)顯示，正常和DNP大鼠急性分離的DRG神經(jīng)元，應(yīng)用BDNF(20ng/2ul)，Ca2+濃度明顯升高。而BDNF刺激經(jīng)反義寡核酸敲除過(guò)TRPC6通道的DNP大鼠的DRG神經(jīng)元，Ca2+濃度變化不大。正常大鼠予以相同處理后Ca2+濃度明顯升高。
　　結(jié)論：TRPC6通道介導(dǎo)了BDNF信號(hào)系統(tǒng)參與的糖尿病神經(jīng)病理性痛機(jī)械性痛敏的形