糖尿病神經(jīng)病理痛的外周鈉通道與TRPC3通道機(jī)制.pdf

1、糖尿病神經(jīng)病理性疼痛(diabeticneuropathicpain,DNP)又稱(chēng)疼痛性糖尿病外周神經(jīng)病變(painfuldiabeticperipheralneuropathy,PDN)是臨床最常見(jiàn)的神經(jīng)病理性疼痛類(lèi)型之一，臨床表現(xiàn)相當(dāng)復(fù)雜，可出現(xiàn)自發(fā)痛、痛覺(jué)過(guò)敏、觸誘發(fā)痛和其他不典型的感覺(jué)異常。糖尿病神經(jīng)病理痛也是一種機(jī)制獨(dú)特且復(fù)雜的慢性疼痛，但是目前對(duì)這類(lèi)特異病痛的發(fā)生機(jī)制了解較少，臨床上也缺乏有效的治療手段，這也成為長(zhǎng)時(shí)期以來(lái)疼

2、痛研究領(lǐng)域關(guān)注的一大難點(diǎn)之一。糖尿病神經(jīng)病理痛嚴(yán)重影響患者的生活質(zhì)量，給患者身心帶來(lái)了巨大痛苦。近年來(lái)，隨著診斷技術(shù)的進(jìn)步以及治療方案的改良，如何改善糖尿病患者的生活質(zhì)量已成為急需解決的問(wèn)題。因此，進(jìn)一步探討糖尿病神經(jīng)病理痛特別是早期糖尿病神經(jīng)病理痛的發(fā)生發(fā)展機(jī)制，尋找緩解糖尿病神經(jīng)病理痛的有效途徑，改善糖尿病患者的生活質(zhì)量，具有重大而又廣泛的臨床價(jià)值和社會(huì)意義，這也是當(dāng)今國(guó)際疼痛研究領(lǐng)域的熱點(diǎn)難點(diǎn)問(wèn)題。
　　鏈脲佐菌素(stre

3、ptozocin,STZ)誘發(fā)I型糖尿病的動(dòng)物模型能夠很好地模擬臨床上糖尿病患者癥狀，是一種典型的神經(jīng)病理性疼痛模型。以前的觀點(diǎn)認(rèn)為，C類(lèi)纖維(C纖維)的功能僅僅是通過(guò)動(dòng)作電位的方式忠實(shí)的傳遞外界傷害性信息，而沒(méi)有對(duì)傷害性信息進(jìn)行整合、加工。然而，最近人們對(duì)C類(lèi)纖維的功能有了新的認(rèn)識(shí)。C類(lèi)纖維不但可以傳遞傷害性信息，還可以在傳遞的過(guò)程中同時(shí)對(duì)傷害性信息的信號(hào)進(jìn)行加工、處理、整合。此外，大量研究表明神經(jīng)異位放電是神經(jīng)病理性疼痛產(chǎn)生和維持的

4、重要機(jī)制之一。Hong等人發(fā)現(xiàn)在早期糖尿病神經(jīng)病理性疼痛大鼠背根神經(jīng)節(jié)(dorsalrootganglion,DRG)神經(jīng)元給予持續(xù)閾上機(jī)械刺激后可以記錄到DRGC類(lèi)神經(jīng)元出現(xiàn)高頻放電，提示C類(lèi)神經(jīng)元高頻放電與早期糖尿病神經(jīng)病理性疼痛大鼠痛覺(jué)過(guò)敏發(fā)生可能有著密切聯(lián)系。此外，Levine實(shí)驗(yàn)室證明在早期糖尿病神經(jīng)病理性疼痛大鼠C類(lèi)纖維中大約三分之一無(wú)髓鞘C纖維對(duì)機(jī)械刺激反應(yīng)具有超敏感性特點(diǎn)，并且C纖維放電頻率出現(xiàn)三倍增加，結(jié)果提示外周傷害

5、性感受器中C類(lèi)纖維和DRGC類(lèi)神經(jīng)元興奮性和可塑性變化可能是誘導(dǎo)早期糖尿病神經(jīng)病理性疼痛大鼠產(chǎn)生傷害性感受感覺(jué)的主要原因。此外，有研究發(fā)現(xiàn)C類(lèi)纖維中炎性因子或介質(zhì)活化可以提高軸突膜興奮性并且還可調(diào)節(jié)C纖維高頻的動(dòng)作電位序列的發(fā)放，損傷的C類(lèi)神經(jīng)纖維能夠改變?cè)械妮S突傳導(dǎo)速度減慢(conductionvelocityslowing,CVs)現(xiàn)象，這些結(jié)果提示C類(lèi)纖維的膜興奮性在炎癥因子的影響下有了顯著的提高。結(jié)合最近我室朱志茹博士在正常生

6、理情況下家兔的隱神經(jīng)上觀察到傳導(dǎo)丟峰(conductionfailure)現(xiàn)象,并且傳導(dǎo)丟峰也可以改變C類(lèi)纖維原有的軸突傳導(dǎo)速度減慢(CVs)過(guò)程，因而，外周C纖維可能是在傷害性信息傳遞的同時(shí)進(jìn)行加工、處理、整合。那么，我們猜想在一些早期糖尿病神經(jīng)病理性疼痛病理情況下在C類(lèi)纖維和DRGC類(lèi)神經(jīng)元，伴隨著傳導(dǎo)丟峰發(fā)生的同時(shí)是否發(fā)生可塑性和興奮性的改變，發(fā)生這些變化的機(jī)制是什么？
　　我室王秀超碩士在早期糖尿病神經(jīng)病理性疼痛大鼠尾神經(jīng)

7、C纖維上應(yīng)用在體單纖維分離技術(shù)記錄大鼠尾神經(jīng)單根C纖維放電序列，結(jié)果發(fā)現(xiàn)，給予持續(xù)的閾上機(jī)械刺激（100g,持續(xù)60s），早期糖尿病神經(jīng)病理性疼痛大鼠大鼠尾神經(jīng)單根C纖維對(duì)機(jī)械刺激的反應(yīng)性較對(duì)照組大鼠顯著增強(qiáng)。此外，向尾神經(jīng)C纖維施加不同頻率的重復(fù)電刺激（2、5、10Hz），結(jié)果發(fā)現(xiàn)糖尿病神經(jīng)病理性疼痛大鼠尾神經(jīng)C纖維與對(duì)照組相比傳導(dǎo)丟峰程度顯著降低，給予低濃度河豚毒素(tetrodotoxin,TTX,100nM)后可以逆轉(zhuǎn)糖尿病神經(jīng)

8、病理痛大鼠尾神經(jīng)單根C纖維傳導(dǎo)丟峰減少現(xiàn)象，提示鈉通道在傳導(dǎo)丟峰過(guò)程中發(fā)揮著重要作用，但這種現(xiàn)象的內(nèi)在機(jī)制大家了解甚少。
　　此外，我室孫薇博士以糖尿病神經(jīng)病理性疼痛大鼠DRG中C類(lèi)神經(jīng)元為研究對(duì)象，應(yīng)用全細(xì)胞膜片鉗技術(shù)記錄capsaicin陽(yáng)性小型神經(jīng)元的放電情況。結(jié)果發(fā)現(xiàn)糖尿病神經(jīng)病理性疼痛大鼠DRGC類(lèi)神經(jīng)元興奮性顯著增高，表現(xiàn)為鈉電流增大，給予TTX(100nM)后發(fā)現(xiàn)可以對(duì)放電情況有顯著抑制。結(jié)果提示鈉通道在C類(lèi)神經(jīng)元發(fā)

9、生了可塑性的變化。鈉通道通過(guò)怎樣的機(jī)制發(fā)揮作用呢？為此，我們重點(diǎn)觀察早期糖尿病神經(jīng)病理性疼痛大鼠DRGC類(lèi)神經(jīng)元和C類(lèi)神經(jīng)元發(fā)出的C纖維中鈉通道Nav1.7、Nav1.8和Nav1.9的表達(dá)改變來(lái)探討興奮性增加和可塑性變化的機(jī)制。
　　主要結(jié)果如下：
　　選用注射STZ后3-4周，具有機(jī)械性痛敏和熱痛敏的早期糖尿病神經(jīng)病理性疼痛大鼠和對(duì)照組大鼠進(jìn)行以下實(shí)驗(yàn)。
　　基于上述放電現(xiàn)象的變化，我們進(jìn)一步采用免疫熒光染色、we

10、sternblot方法觀察在鈉通道蛋白Nav1.7、Nav1.8和Nav1.9在早期糖尿病神經(jīng)病理性疼痛大鼠的表達(dá)改變。
　　1.Nav1.7在尾神經(jīng)C類(lèi)纖維和DRGC類(lèi)神經(jīng)元胞體的表達(dá)情況。實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)Nav1.7作為一種典型的TTX敏感鈉離子通道，在糖尿病神經(jīng)病理性疼痛大鼠DRGC類(lèi)神經(jīng)元和尾神經(jīng)C纖維表達(dá)上調(diào)。免疫熒光雙標(biāo)染色發(fā)現(xiàn)在對(duì)照組大鼠DRG中大約有42±6％的peripherin(C類(lèi)纖維和C類(lèi)神經(jīng)元特異標(biāo)記物)陽(yáng)性的神

11、經(jīng)元共標(biāo)記Nav1.7。在糖尿病神經(jīng)病理性疼痛大鼠DRG中大約有92±3％peripherin陽(yáng)性的神經(jīng)元共標(biāo)記Nav1.7。結(jié)果提示Nav1.7在糖尿病神經(jīng)病理性疼痛大鼠的表達(dá)較對(duì)照組有顯著升高(n=4,p<0.05)。同時(shí)發(fā)現(xiàn)，在對(duì)照組大鼠DRG中peripherin與Nav1.7共標(biāo)記的神經(jīng)元的熒光強(qiáng)度為24.5±4.7，在糖尿病神經(jīng)病理性疼痛大鼠DRG中peripherin與Nav1.7共標(biāo)記的神經(jīng)元的熒光強(qiáng)度為50.5±4.0

12、。結(jié)果提示Nav1.7在糖尿病神經(jīng)病理性疼痛大鼠DRG神經(jīng)元的熒光強(qiáng)度較對(duì)照組有顯著升高(n=4,p<0.05)。此外還發(fā)現(xiàn)，在對(duì)照組大鼠尾神經(jīng)C纖維中peripherin與Nav1.7共標(biāo)記的C纖維的熒光強(qiáng)度為15.5±4.2，在糖尿病神經(jīng)病理性疼痛大鼠尾神經(jīng)中peripherin與Nav1.7共標(biāo)記的C纖維的熒光強(qiáng)度為43.0±5.5。結(jié)果提示Nav1.7在糖尿病神經(jīng)病理性疼痛大鼠尾神經(jīng)C纖維的熒光強(qiáng)度較對(duì)照組有顯著升高(n=4,p

13、<0.05)。此外，Westernblot結(jié)果半定量分析顯示，糖尿病神經(jīng)病理性疼痛大鼠和對(duì)照組相比Nav1.7離子通道蛋白表達(dá)量在尾神經(jīng)和DRG神經(jīng)元均明顯升高，而β-Actin則無(wú)明顯差異(n=4,p<0.05)。
　　2.Nav1.8在尾神經(jīng)C類(lèi)纖維和DRGC類(lèi)神經(jīng)元胞體的表達(dá)情況。實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)Nav1.8作為一種典型的TTX不敏感鈉離子通道，在糖尿病神經(jīng)病理性疼痛大鼠DRGC類(lèi)神經(jīng)元和尾神經(jīng)C纖維表達(dá)上調(diào)。免疫熒光雙標(biāo)染色發(fā)現(xiàn)在

14、對(duì)照組大鼠DRG中大約有48±7.7％的peripherin陽(yáng)性的神經(jīng)元共標(biāo)記Nav1.8。在糖尿病神經(jīng)病理性疼痛大鼠DRG中大約有77±6％peripherin陽(yáng)性的神經(jīng)元共標(biāo)記Nav1.8。結(jié)果提示Nav1.8在糖尿病神經(jīng)病理性疼痛大鼠的表達(dá)較對(duì)照組有顯著升高(n=4,p<0.05)。同時(shí)發(fā)現(xiàn)，在對(duì)照組大鼠DRG中peripherin與Nav1.8共標(biāo)記的神經(jīng)元的熒光強(qiáng)度為28.8±7.3，在糖尿病神經(jīng)病理性疼痛大鼠DRG中peri

15、pherin與Nav1.8共標(biāo)記的神經(jīng)元的熒光強(qiáng)度為71.8±7.43。結(jié)果提示Nav1.8在糖尿病神經(jīng)病理性疼痛大鼠DRG神經(jīng)元的熒光強(qiáng)度較對(duì)照組有顯著升高(n=4,p<0.05)。此外還發(fā)現(xiàn)，在對(duì)照組大鼠尾神經(jīng)C纖維中peripherin與Nav1.8共標(biāo)記的C纖維的熒光強(qiáng)度為16.3±2.8，在糖尿病神經(jīng)病理性疼痛大鼠尾神經(jīng)中peripherin與Nav1.8共標(biāo)記的C纖維的熒光強(qiáng)度為39.2±8.7。結(jié)果提示Nav1.8在糖尿病

16、神經(jīng)病理性疼痛大鼠尾神經(jīng)C纖維的熒光強(qiáng)度較對(duì)照組有顯著升高(n=4,p<0.05)。此外，Westernblot結(jié)果半定量分析顯示，糖尿病神經(jīng)病理性疼痛大鼠和對(duì)照組相比Nav1.8離子通道蛋白表達(dá)量在尾神經(jīng)和DRG神經(jīng)元均明顯升高，而β-Actin則無(wú)明顯差異(n=4,p<0.05)。
　　3.Nav1.9在尾神經(jīng)C類(lèi)纖維和DRGC類(lèi)神經(jīng)元胞體的表達(dá)情況。實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)Nav1.9作為一種典型的TTX不敏感鈉離子通道，在糖尿病神經(jīng)病理性

17、疼痛大鼠DRGC類(lèi)神經(jīng)元和尾神經(jīng)C纖維表達(dá)上調(diào)。免疫熒光雙標(biāo)染色發(fā)現(xiàn)在對(duì)照組大鼠DRG中大約有41±6％的peripherin陽(yáng)性的神經(jīng)元共標(biāo)記Nav1.9。在糖尿病神經(jīng)病理性疼痛大鼠DRG中大約有82±8％peripherin陽(yáng)性的神經(jīng)元共標(biāo)記Nav1.9。結(jié)果提示Nav1.9在糖尿病神經(jīng)病理性疼痛大鼠的表達(dá)較對(duì)照組有顯著升高(n=4,p<0.05)。同時(shí)發(fā)現(xiàn)，在對(duì)照組大鼠DRG中peripherin與Nav1.9共標(biāo)記的神經(jīng)元的熒光

18、強(qiáng)度為19.4±1.9，在糖尿病神經(jīng)病理性疼痛大鼠DRG中peripherin與Nav1.9共標(biāo)記的神經(jīng)元的熒光強(qiáng)度為36.2±6.72。結(jié)果提示Nav1.9在糖尿病神經(jīng)病理性疼痛大鼠DRG神經(jīng)元的熒光強(qiáng)度較對(duì)照組有顯著升高(n=4,p<0.05)。此外還發(fā)現(xiàn)，在對(duì)照組大鼠尾神經(jīng)C纖維中peripherin與Nav1.9共標(biāo)記的C纖維的熒光強(qiáng)度為10.1±2.5，在糖尿病神經(jīng)病理性疼痛大鼠尾神經(jīng)中peripherin與Nav1.9共標(biāo)記

19、的C纖維的熒光強(qiáng)度為29.4±2.7。結(jié)果提示Nav1.9在糖尿病神經(jīng)病理性疼痛大鼠尾神經(jīng)C纖維的熒光強(qiáng)度較對(duì)照組有顯著升高(n=4,p<0.05)。
　　結(jié)論：以上結(jié)果顯示在早期糖尿病神經(jīng)病理性疼痛大鼠DRGC類(lèi)神經(jīng)元發(fā)出的C類(lèi)纖維和DRGC類(lèi)神經(jīng)元的鈉通道Nav1.7、Nav1.8和Nav1.9表達(dá)顯著上調(diào)。結(jié)果提示，鈉通道的表達(dá)上調(diào)可能是傷害性信息在C類(lèi)纖維傳遞過(guò)程中發(fā)生加工、處理、整合的細(xì)胞分子機(jī)制。同樣，鈉通道表達(dá)上調(diào)可