TRPC6及BKCa通道蛋白在小鼠腎皮質和海馬發(fā)育中表達的研究.pdf

1、實驗背景:
　　瞬時受體電位陽離子通道6(TRPC6)，作為TRPC家族的成員之一，最近引起公眾越來越多的關注，因為它與很多疾病相關。研究指出，在腦和腎臟中，TRPC6參與多項生理功能。
　　大電導鈣激活鉀離子通道（BKCa通道）廣泛表達于機體中多種細胞，并在許多生理及病理條件下，發(fā)揮著舉足輕重的作用。然而BKCa通道在小鼠生后發(fā)育過程中腎皮質和海馬的分布與表達還沒有報道。
　　此外，TRPC6作為一個重要的離子通道在

2、腎臟中主要在足細胞中表達，研究發(fā)現足細胞中的TRPC6對足細胞中的細胞信號轉導的鈣穩(wěn)態(tài)的調節(jié)起著至關重要的作用。其中，足細胞是一個很特別的細胞類型，它包裹著的腎小球毛細血管。足細胞是腎小球毛細血管上皮細胞，或稱腎小囊臟層細胞，屬于一種終末分化細胞。足細胞最近一直成為大家的研究熱點，因為它的缺失和病變都有引發(fā)腎臟發(fā)育的缺陷，甚至導致許多疾病。正是由于足細胞在腎臟發(fā)育和疾病發(fā)生過程中發(fā)揮的關鍵作用，引發(fā)了越來越多的研究者著重于足細胞上的離子

3、通道的研究。其中很重要的兩個通道就是TRPC6通道和BKCa通道。研究發(fā)現BKCa通道作為位于足細胞上的一種重要的離子通道，它在調節(jié)鈣穩(wěn)態(tài)的細胞信號轉導中發(fā)揮著重要作用。
　　實驗目的:
　　1)觀察和闡明TRPC6和BKCa通道在小鼠出生后發(fā)育的不同時期，在腎皮質和海馬中的分布和表達。
　　2)探討足細胞分化過程中的細胞形態(tài)學隨分化成熟的變化。
　　3)探討足細胞發(fā)育過程中，離子通道（TRPC6通道和BKCa通

4、道）分布和表達的變化。
　　4)探討足細胞分化過程中，TRPC6通道和BKCa通道電流的變化。
　　實驗方法:
　　1)在第一部分研究中，我們選取了6-8周的成年C57小鼠雌雄同籠，設定子代出生后當天為出生后0天(P0)。然后取出生后1天，3天，5天，7天，14天，21天，28天和49天（P1，P3，P5，P7，P14，P21，P28和P49）的小鼠，取腦和腎臟，切片或者提蛋白。采用免疫組化和免疫印記的方法檢測TRPC

5、6通道以及BKCa通道在腎皮質和海馬中的分布和表達。
　　2)在第二部分的實驗研究中，我們采用了小鼠永生足細胞系MPCs作為實驗對象，培養(yǎng)未分化的足細胞，然后去除限制性因素使足細胞進入分化成熟階段。取未分化，分化3，6，9，12，及成熟的足細胞（d0，d3，d6，d9，d12和mature）進行形態(tài)學觀察，以及免疫組化，免疫印記實驗以及全細胞膜片鉗，研究足細胞隨分化的形態(tài)變化，TRPC6通道以及BKCa通道在足細胞分化過程中的分布

6、與表達及其功能變化。
　　實驗結果:
　　1) TRPC6在腎小體發(fā)育的各個時期以及海馬的各區(qū)都有表達。在海馬中TRPC6的表達量增加，在出生后P7和P14之間表達量呈現一個顯著的增加。同時， TRPC6在腎皮質，尤其是腎小球的表達隨發(fā)育過程呈下降趨勢。
　　2) BKCa通道在小鼠出生后的所有的時間點的腎小管和腎小球都有發(fā)現，其中包括腎小體的四個時期，如逗號狀的身體，S形身材，Ⅲ期和Ⅳ期腎小體。在發(fā)育過程中，BKCa

7、通道的表達明顯降低，其中最大的變化是P7和P14之間的。與此相對應，BKCa通道在每個時間點的海馬所有區(qū)域都有表達，且在P1-P14含量逐漸增加，其中P7和P14之間的有一個迅速的增加。
　　3)我們的研究結果表明，TRPC6通道的分布隨足細胞分化成熟而改變。而且隨著分化，細胞表面TRPC6表達的熒光強度逐漸增加，同時全細胞TRPC6通道電流也隨之增加。
　　4) BKCa通道的分布隨足細胞系的分化成熟而改變。此外，激光共聚

8、焦顯微鏡觀察到，隨著足細胞的分化，細胞表面的BKCa通道蛋白表達增加。這與我們提取不同分化時期的足細胞的膜蛋白，然后進行的免疫印記的結果是一致的。此外，膜片鉗實驗結果顯示BKCa通道電流的變化也與上述結果相符。
　　實驗結論:
　　1) TRPC6在小鼠出生后發(fā)育過程中，在腎皮質中的表達逐漸降低，而在海馬中的表達量逐漸增高。這些數據表明，TRPC6不僅參與維持腎皮質的相關功能，而且對于大腦中海馬的發(fā)育也是十分重要的。

9、　　2)本研究的結果表明，BKCa通道在小鼠出生后腎皮質和海馬發(fā)育過程中發(fā)揮了重要作用。而在腎皮質和海馬，BKCa通道發(fā)揮的功能可能有所不同。從而為以后有關研究腎臟和海馬發(fā)育及相關作用，提供了理論基礎，更為進一步臨床研究提供理論依據。
　　3) TRPC6隨發(fā)育變化說明TRPC6可能參與了足細胞的成熟和相關的生理功能。這些有關腎臟生理和發(fā)育的結果，為今后探討足細胞上相關離子通道的研究提供了理論基礎。
　　4)隨著足細胞的成熟