熱射病小鼠中樞神經(jīng)系統(tǒng)炎癥和外周炎癥的變化.pdf

1、目的：
　　熱射病(heat strok，HS)是一種死亡率極高的重癥中暑，患者的核心溫度(coretemperature，Tc)通常高于40℃，并有中樞神經(jīng)系統(tǒng)異常，重者常出現(xiàn)全身系統(tǒng)性炎癥(systemic inflammatory response Syndrome，SIRS)、多器官功能障礙綜合征(multiple organ dysfunction syndrome，MODS)等嚴(yán)重并發(fā)癥。中樞神經(jīng)損害是熱射病主要臨床特

2、征，多表現(xiàn)為認(rèn)知功能減退、共濟(jì)失調(diào)、澹妄、驚厥、昏迷等。由于熱射病腦損傷因發(fā)生時(shí)間早且危害大，已成為熱射病損傷防治關(guān)注的焦點(diǎn)。
　　有關(guān)熱射病腦損傷的機(jī)制，已有研究證明熱刺激可直接損傷腦細(xì)胞及其內(nèi)部結(jié)構(gòu)，誘導(dǎo)神經(jīng)細(xì)胞凋亡或壞死。除了熱應(yīng)激直接引起中樞神經(jīng)系統(tǒng)損傷外，近年來有學(xué)者提出熱射病腦損傷的發(fā)生可能與中樞神經(jīng)炎癥相關(guān)。熱射病可引起SIRS，全身多個(gè)組織臟器發(fā)生嚴(yán)重炎癥反應(yīng)，中樞神經(jīng)系統(tǒng)觀察到也有炎癥反應(yīng)發(fā)生，炎癥介質(zhì)可使細(xì)胞功

3、能受損并加速神經(jīng)元凋亡，使熱射病患者預(yù)后欠佳，可發(fā)生認(rèn)知功能障礙、記憶力減退以及精神失常等。但是熱射病中樞神經(jīng)炎癥反應(yīng)究竟是繼發(fā)于外周炎癥反應(yīng)，還是高熱刺激直接引起中樞神經(jīng)系統(tǒng)原發(fā)性炎癥反應(yīng)，目前還缺乏深入研究。而這對(duì)于指導(dǎo)臨床救治熱射病，減輕中樞神經(jīng)損傷具有重要意義。
　　熱射病的高死亡率與病程中發(fā)生MODS相關(guān)，中暑的病理生理學(xué)機(jī)制目前仍未完全清楚闡明，近年來研究發(fā)現(xiàn)熱射病的病理生理過程與內(nèi)毒素血癥極為相似。熱射病后血清中內(nèi)毒

4、素濃度升高，可導(dǎo)致單核巨噬細(xì)胞及中性粒細(xì)胞的活化，分泌TNFα、IL-1β、IL-6等炎癥因子，并呈級(jí)聯(lián)放大瀑布效應(yīng)，促使SIRS的發(fā)生，進(jìn)而出現(xiàn)MODS，損害多個(gè)器官的正常功能。但內(nèi)毒素是否來源于腸道、腸源性內(nèi)毒素血癥是否是導(dǎo)致SIRS發(fā)生的主要機(jī)理目前仍存在爭(zhēng)論。
　　血腦屏障和腸道屏障是隔絕腦組織、腸道內(nèi)容物與外周血液的重要結(jié)構(gòu)。正常情況下血腦屏障可阻斷有害的物質(zhì)通過血液進(jìn)入腦組織，如果血腦屏障結(jié)構(gòu)破壞，通透性增高，外周血中

5、炎癥介質(zhì)進(jìn)入中樞神經(jīng)系統(tǒng)，可引起繼發(fā)性中樞炎癥反應(yīng)。而腸道屏障則是防止腸道內(nèi)細(xì)菌及其產(chǎn)生的有害物質(zhì)進(jìn)入外周血。因此觀察熱射病后血腦屏障及腸道屏障的損傷程度、隨時(shí)間的變化規(guī)律以及損傷后對(duì)中樞和外周炎癥所產(chǎn)生的影響，對(duì)揭示中樞神經(jīng)系統(tǒng)炎癥、外周炎癥的病理生理機(jī)制以及相互關(guān)系具有重要作用。
　　因此，本課題旨在通過建立熱射病腦損傷模型，研究熱射病后中樞神經(jīng)系統(tǒng)炎癥和外周炎癥的變化情況，以及在此過程中血腦屏障及腸道屏障的損傷程度及變化規(guī)律

6、，以揭示中樞神經(jīng)系統(tǒng)炎癥、外周炎癥的病理生理機(jī)制及相互關(guān)系，為臨床救治熱射病腦損傷提供新的參考依據(jù)。
　　方法：
　　1.使用健康BALB/c小鼠，12周齡，雄性，重量（29.1±0.6）g，在(41.2±0.5)℃，濕度（60±2）％中持續(xù)暴露至小鼠直腸溫度(rectaltemperature，Tre)達(dá)到（42.4±0.2）℃建立熱射病小鼠模型，Tre表示其核心溫度。小鼠分成正常對(duì)照組(CON)、熱射病恢復(fù)1h組(HS-

7、1h)、熱射病恢復(fù)6h組(HS-6h)和熱射病恢復(fù)24h組(HS-24h)。對(duì)比觀察各組小鼠在高溫模擬艙中及熱射病后的表現(xiàn)，艙室內(nèi)及出艙后Tre變化和生存率情況，利用HE染色和透射電鏡(transmission electron microscope，TEM)觀察大腦組織病理變化。
　　2.通過實(shí)時(shí)定量熒光PCR(quantitative real-time PCR，qPCR)和酶聯(lián)免疫吸附測(cè)定（enzyme linked imm

8、unosorbent assay，ELISA）檢測(cè)各組小鼠大腦皮層及海馬TNF-α、IL-1β和IL-6基因及蛋白表達(dá)，探討熱射病后各恢復(fù)時(shí)相點(diǎn)大腦炎癥的變化情況。
　　3.通過ELISA檢測(cè)各組小鼠外周血清TNF-α、IL-1β和IL-6含量，鱟試劑動(dòng)態(tài)濁度法測(cè)定各組小鼠血清中內(nèi)毒素，探討各恢復(fù)時(shí)相點(diǎn)血清內(nèi)毒素與炎癥的相關(guān)性;利用qPCR檢測(cè)各組小鼠脾臟炎癥因子的表達(dá)，系統(tǒng)評(píng)價(jià)熱射病恢復(fù)期的外周炎癥反應(yīng)。
　　4.通過HE

9、染色和TEM觀察各組小鼠血腦屏障及腸道屏障結(jié)構(gòu)相關(guān)的病理變化，伊文思藍(lán)(evans blue，EB)含量測(cè)定以及免疫印跡試驗(yàn)(western blot，WB)檢測(cè)基質(zhì)金屬蛋白酶2(matrix metalloprotein，MMP-2)、基質(zhì)金屬蛋白酶9(matrix metalloprotein，MMP-9)表達(dá)，反映小鼠血腦屏障的通透性變化，F(xiàn)ITC標(biāo)記葡聚糖4(FITC-Dextran4,FD4)透過率檢測(cè)，反應(yīng)熱射病后各組小鼠腸

10、道屏障的通透性變化。
　　結(jié)果：
　　1.在（41.2±0.5）℃、濕度（60±2）％環(huán)境中持續(xù)暴露至小鼠Tre達(dá)（42.4±0.2）℃建立了小鼠熱射病模型，并按照熱射病后不同恢復(fù)時(shí)相點(diǎn)分為CON組、HS-1h組、HS-6h組和HS-24h組;艙內(nèi)小鼠出現(xiàn)躁動(dòng)、脫水、澹妄至活動(dòng)減少甚至昏迷，出艙后HS-1h組小鼠Tre明顯降低，表現(xiàn)為低體溫期，HS-24h組小鼠Tre略高于CON組，表現(xiàn)為發(fā)熱期;HE染色和TEM在熱射病小鼠

11、觀察到細(xì)胞周圍水腫、細(xì)胞核固縮裂解、內(nèi)質(zhì)網(wǎng)紊亂等，表明熱應(yīng)激導(dǎo)致小鼠中樞神經(jīng)細(xì)胞出現(xiàn)明顯病理變化，熱射病中樞神經(jīng)損傷小鼠模型成功建立。
　　2.HS-1h組、HS-6h組小鼠大腦皮層和海馬炎癥因子TNF-α、IL-1β和IL-6的基因表達(dá)及蛋白合成明顯增多，與CON組相比較差異明顯(P＜0.01)，HS-24h組小鼠大腦皮層和海馬炎癥因子與CON組無明顯差異(P＞0.05)，提示熱射病恢復(fù)期6h內(nèi)中樞神經(jīng)系統(tǒng)有明顯炎癥反應(yīng)，以恢復(fù)

12、期1h最為嚴(yán)重，在24h基本恢復(fù)正常水平。
　　3.與CON組比較，HS-1h組、HS-6h組和HS-24h組小鼠外周血清炎癥因子TNF-α、IL-1β、IL-6和內(nèi)毒素濃度明顯升高，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.01)，在HS-1h組的炎癥因子和HS-6h組的內(nèi)毒素濃度最高，之后逐漸下降，但到24h后仍高于對(duì)照(P＜0.01);熱射病各組小鼠脾臟炎癥因子TNF-α、IL-1β、IL-6的表達(dá)均高于CON組(P＜0.01)，在恢復(fù)1h

13、達(dá)到最高，變化趨勢(shì)與外周血清基本一致，結(jié)果提示熱射病恢復(fù)期24h內(nèi)持續(xù)出現(xiàn)明顯的外周炎癥反應(yīng)。
　　4.HE染色和TEM觀察到了大腦微血管周圍水腫以及血管管腔的壓迫、血管內(nèi)皮細(xì)胞連接不緊密以及腫脹和內(nèi)皮消失，在小腸粘膜發(fā)現(xiàn)腸絨毛變短、稀疏、絨毛缺失，說明熱射病對(duì)小鼠血腦屏障和腸道屏障結(jié)構(gòu)造成了病理?yè)p傷;在HS-1h組、HS-6h組小鼠大腦MMP-2、MMP-9蛋白合成顯著增多，與CON組相比差異明顯(P＜0.01)，HS-24h組

14、有所恢復(fù)，但仍然高于CON組(P＜0.01);HS-1h組和HS-6h組小鼠EB在大腦中含量與CON組相比明顯增多(P＜0.01)，HS-24h組仍高于CON組(P＜0.01)，說明熱射病恢復(fù)期24h內(nèi)小鼠血腦屏障的破壞，透通性增高;HS-1h組、HS-6h組和HS-24h組小鼠血清FD4濃度明顯增加，與CON組比較有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.01)，提示熱射病使小鼠腸道屏障透通性增高且一直持續(xù)至24h。
　　結(jié)論：
　　1.熱射

15、病后恢復(fù)期6h內(nèi)中樞神經(jīng)系統(tǒng)出現(xiàn)明顯的炎癥反應(yīng)，至24h基本恢復(fù)正常。中樞神經(jīng)炎癥與熱射病中樞神經(jīng)損傷密切相關(guān)。
　　2.熱射病導(dǎo)致腸道屏障的結(jié)構(gòu)破壞和通透性增加，腸道中內(nèi)毒素可能通過腸道屏障進(jìn)入血液循環(huán)，致使熱射病后恢復(fù)期24h內(nèi)均發(fā)生明顯外周炎癥反應(yīng)。
　　3.熱射病導(dǎo)致血腦屏障的結(jié)構(gòu)破壞和通透性增加，熱射病恢復(fù)期6h內(nèi)，外周炎癥可能因?yàn)檠X屏障通透性增加從而影響中樞炎癥的發(fā)生，但熱射病恢復(fù)期24h，中樞神經(jīng)炎癥表現(xiàn)為獨(dú)