鞘脂代謝紊亂在亞臨床甲減所致流產(chǎn)中的作用——臨床和動(dòng)物實(shí)驗(yàn)研究.pdf

1、目的:
　　亞臨床甲狀腺功能減退癥（亞臨床甲減）被定義為促甲狀腺激素(TSH)水平升高，而血清甲狀腺激素（總甲狀腺素TT4或游離甲狀腺素FT4）正常。亞臨床甲減是最常見的妊娠相關(guān)性甲狀腺疾病。妊娠期促甲狀腺激素和游離甲狀腺素的正常參考范圍與非妊娠婦女不同，妊娠各期參考范圍具有階段特異性。本研究組最新的調(diào)查結(jié)果也推薦使用妊娠特異性參考范圍。大量研究提示妊娠期亞臨床甲減與多種產(chǎn)科并發(fā)癥如早產(chǎn)、妊娠期高血壓、流產(chǎn)和胎盤早剝等有關(guān)。而研究

2、顯示妊娠早期TSH即使在2.5mIU/L至妊娠特異參考范圍之間，自然流產(chǎn)的發(fā)生風(fēng)險(xiǎn)也會(huì)提高。鞘脂代謝在妊娠過程中發(fā)揮了重要作用，包括精子形成、卵巢功能、胚胎植入、妊娠維持和分娩，其代謝紊亂與不良妊娠結(jié)局，包括流產(chǎn)、子癇等有關(guān)。鞘脂是一類以鞘氨醇為骨架的復(fù)雜化合物，包括簡單鞘脂如鞘氨醇、神經(jīng)酰胺（Ceramide，CER）和其代謝產(chǎn)物1-磷酸鞘氨醇(Sphingosine-1-phosphate，S1P)，復(fù)雜的鞘脂如鞘磷脂、神經(jīng)節(jié)苷脂等

3、糖基化衍生物。甲狀腺激素(T3，T4)也能調(diào)節(jié)包括鞘磷脂(SM)/CER途徑的多種細(xì)胞信號(hào)。S1P作為鞘脂代謝產(chǎn)物之一，是鞘脂代謝途徑中具有生物活性的主要效應(yīng)分子。S1P由鞘氨醇激酶(sphingosine kinases，SPHK)催化產(chǎn)生，通過兩種磷酸酶(SGPP1、SGPP2)可逆性去磷酸化失活，最終由一種裂解酶(SGPL1)降解。S1P主要通過作為G蛋白家族偶聯(lián)受體（Sphingosine-1-phosphate recepto

4、r,S1PR1-5）的配體來發(fā)揮其生物學(xué)作用。研究提示鞘脂代謝在維持妊娠中起作用，如通過抑制凋亡、促進(jìn)血管形成等促進(jìn)卵巢黃體發(fā)育、促進(jìn)子宮蛻膜化的發(fā)生、母胎免疫調(diào)節(jié)和維持滋養(yǎng)層細(xì)胞功能。
　　隨著妊娠婦女亞臨床甲減患病率的增加，其在導(dǎo)致流產(chǎn)中的作用受到日益關(guān)注。妊娠早期母體亞臨床甲減如何導(dǎo)致流產(chǎn)發(fā)生的機(jī)制目前尚不清楚。本研究旨在建立亞臨床甲減孕鼠模型的基礎(chǔ)上，觀察亞臨床甲減是否導(dǎo)致了流產(chǎn)的發(fā)生，測定鞘脂代謝產(chǎn)物S1P的相關(guān)酶、S1

5、P受體(S1PR1-5)變化;并進(jìn)一步在妊娠早期亞臨床甲減自然流產(chǎn)婦女中檢測是否發(fā)生上述改變，從臨床和動(dòng)物實(shí)驗(yàn)中探討鞘脂代謝紊亂在亞臨床甲減所致流產(chǎn)中的作用。
　　研究方法:
　　第一部分
　　1、完全切除甲狀腺組織手術(shù)、完全切除甲狀腺組織手術(shù)加術(shù)后L-T4補(bǔ)充及假手術(shù)方法，分別建立臨床甲減(CH)、亞臨床甲減(SCH)、正常對照(CON)Wistar孕鼠模型，通過測定血清TSH、TT4濃度驗(yàn)證動(dòng)物模型建立情況。大鼠交

6、配受孕后，分別在孕0天(G0)、孕5天(G5)、孕13天(G13)三個(gè)時(shí)間點(diǎn)處死。于孕13天觀察胚胎吸收情況，計(jì)算胚胎吸收率。留取胎盤、卵巢組織，并稱重，比較胎盤及胚胎組織重量之間差異。分別測定孕期母鼠血清TSH、TT4，明確孕期甲狀腺功能。
　　2、HE及糖原染色(PAS)觀察胎盤組織形態(tài)。利用RT-PCR及Western blot方法檢測G13天胎盤及G0、G5、G13天卵巢黃體組織S1P受體(S1PR1-5)、SPHK、甲狀

7、腺激素受體(TRα、TRβ)及促甲狀腺激素受體(TSHR)的mRNA表達(dá)及蛋白水平。Western blot方法檢測G13天胎盤組織促血管生成因子(VEGF)、絲裂原活化蛋白激酶(MEK)/細(xì)胞外蛋白激酶(ERK)/基質(zhì)金屬蛋白酶2(MMP2)及抑制物-組織金屬蛋白酶抑制物2（TIMP2）蛋白水平。免疫熒光方法檢測胎盤組織VEGF表達(dá)情況。TUNEL染色觀察胎盤組織凋亡情況。
　　第二部分
　　1、于中國醫(yī)科大學(xué)附屬第一醫(yī)院

8、婦科門診收集亞臨床甲減流產(chǎn)組（SCH組）及自愿中止妊娠的正常對照組（CON組）。SCH組入組標(biāo)準(zhǔn)為TSH≥2.5mIU/L。收集患者血液標(biāo)本、術(shù)后新鮮蛻膜組織及絨毛組織。所有受試者入組時(shí)均填寫受試者年齡，身高，體重，孕齡，流產(chǎn)史等一般情況，教育程度，人均收入情況，吸煙史，飲酒史及其他自身免疫性疾病史。比較兩組一般人群特征。
　　2、血清標(biāo)本分別用于測定甲狀腺功能和抗體(FT3、FT4、TSH、TPOAb、TgAb)、絨毛膜促性腺激

9、素(β-HCG)、孕酮(P4)、雌二醇(E2)。新鮮全血用于進(jìn)行外周血NK細(xì)胞(CD56+CD16+)流式細(xì)胞學(xué)檢測。比較其有無統(tǒng)計(jì)學(xué)差異。
　　3、采用流式細(xì)胞學(xué)檢測兩組蛻膜組織NK細(xì)胞(CD56+CD16-)比例。利用RT-PCR檢測蛻膜及絨毛組織S1PR1-5、SPHK、SGPP1、SGPP2、SGPL1及TRα、TRβ、TSHR mRNA表達(dá)。利用Western blot方法檢測兩組S1PR1-5、TRα、TRβ、TSHR

10、、MMP2、TIMP2及VEGF蛋白水平。
　　結(jié)果:
　　第一部分
　　1、模型建立時(shí)及G0、G5及G13天，CH組血清TSH高于CON組(p＜0.05)，TT4小于最小值，SCH組血清TSH高于CON組(p＜0.05)，T4與CON組相比無統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(p＞0.05)，提示三組建模成功，且在整個(gè)孕期保持穩(wěn)定。G13天CH組與SCH組胚胎吸收率較CON組明顯升高(p＜0.05)，而胚胎及胎盤重量明顯降低(p＜0.05)

11、，提示SCH與CH一樣，導(dǎo)致了流產(chǎn)的發(fā)生。
　　2、HE及糖原染色結(jié)果顯示，與CON組相比，CH組及SCH組胎盤總面積減少（40*）(p＜0.05)，但各區(qū)域占總面積的比值無統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(p＞0.05)。胎盤緊密連接區(qū)(JZ)細(xì)胞密度（400*）于三組間無統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(p＞0.05)，蛻膜區(qū)及迷路區(qū)均可見細(xì)胞密度顯著降低(p＜0.05)。SCH和CH組JZ區(qū)中糖原細(xì)胞比例明顯增加（400*）(p＜0.05)。
　　3、G13天胎

12、盤TRβ、TSHR、S1PR3、S1PR4、S1PR5mRNA表達(dá)在三組間均無統(tǒng)計(jì)學(xué)差異。SCH組TRα、S1PR1、S1PR2、SPHK mRNA表達(dá)明顯高于CON組(p＜0.05)，而CH組與CON組無統(tǒng)計(jì)學(xué)差異。胎盤組織TRα、S1PR1、S1PR2、SPHK蛋白水平在三組間的表達(dá)趨勢與mRNA表達(dá)結(jié)果相一致。SCH組和CH組與CON組相比，MEK1/2、p-ERK、MMP2及VEGF蛋白水平顯著降低(p＜0.05)，總的ERK水

13、平雖趨勢一致，但無統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(p＞0.05)。TIMP2蛋白水平于CH組水平明顯升高，且有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(p＜0.05)。
　　4、與CON組相比，G0天卵巢黃體組織CH組TRβ mRNA表達(dá)明顯降低(p＜0.05)，S1PR4、S1PR5mRNA表達(dá)明顯升高(p＜0.05)，SGPL1 mRNA表達(dá)在CH組和SCH組中均明顯降低(p＜0.05); G5天卵巢黃體組織TRβ、SGPP1mRNA表達(dá)在CH組明顯降低(p＜0.05)，TR

14、α mRNA表達(dá)在CH組和SCH組中均明顯降低(p＜0.05); G13天卵巢黃體組織SCH組TRβ、TSHR、S1PR4、S1PR5、SGPP2mRNA表達(dá)升高(p＜0.05)，TRα、S1PR1、S1PR2、S1PR3、SPHK mRNA表達(dá)在SCH組與CH組中呈一致性升高(p＜0.05)。
　　5、免疫熒光染色顯示SCH組和CH組胎盤組織中漿染的VEGF蛋白低于CON組。TUNEL染色可見CH組胎盤組織凋亡細(xì)胞較SCH組和C

15、ON組明顯增加。
　　第二部分
　　1、比較兩組人群一般情況，發(fā)現(xiàn)兩組年齡、妊娠周齡存在統(tǒng)計(jì)學(xué)差異，SCH組年齡及妊娠周齡均大于CON組(p＜0.05)。BMI、受教育程度、人均收入及吸煙飲酒史均無統(tǒng)計(jì)學(xué)差異。
　　2、CON組及SCH組TSH中位數(shù)分別為1.23及3.03 mIU/L。比較兩組間FT4、FT3、TPOAb及TgAb水平，未見統(tǒng)計(jì)學(xué)差異。β-HCG、E2、P4在SCH組均顯著低于CON組(p＜0.05)

16、。
　　3、外周血NK細(xì)胞(CD56+CD16+)比例在SCH組（15.05±0.87％）高于CON組（11.37±1.57％）(p＜0.05)。蛻膜NK細(xì)胞(CD56+CD16-)比例在SCH組（56.72±5.07％）明顯低于CON組（68.51±3.23％）(p＜0.05)。
　　4、SCH組蛻膜組織TRα、TRβmRNA表達(dá)高于CON組，但無統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(p＞0.05)，S1PR1、SPHK1及SGPL1 mRNA表達(dá)

17、顯著高于CON組(p＜0.05)，具有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異。而S1PR2-4、SPHK2及SGPP1、SGPP2 mRNA在兩組間比較未見統(tǒng)計(jì)學(xué)差異。SCH組絨毛組織TRα、TRβ mRNA均高于CON組，TRαmRNA的表達(dá)在兩組間有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(p＜0.05)，S1PR1、S1PR2、S1PR3 mRNA表達(dá)均明顯高于CON組，且有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(p＜0.05)。
　　5、SCH組蛻膜組織中S1PR1蛋白水平高于CON組，具有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(p＜

18、0.05)，與mRNA表達(dá)相一致。S1PR2-5、TSHR、TRα、TRβ、TIMP2及VEGF的蛋白水平在SCH組和CON組之間無統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(p＞0.05)。MMP2蛋白水平在SCH組蛻膜組織明顯高于CON組，具有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(p＜0.05)。與CON組相比，SCH組絨毛組織S1PR1、S1PR2、S1PR3、TSHR、TRα的蛋白水平升高，具有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(p＜0.05)。SCH組絨毛組織MMP2蛋白水平較CON組顯著降低(p＜0.05