妊娠期母體亞臨床甲減對(duì)后代智力和腦發(fā)育相關(guān)基因表達(dá)影響的動(dòng)物實(shí)驗(yàn)研究.pdf

1、目的： 甲狀腺激素對(duì)于中樞神經(jīng)系統(tǒng)的分化和發(fā)育具有十分廣泛而顯著的影響，胎兒期和出生后早期甲狀腺激素缺乏將造成不可逆的腦損傷，引起嚴(yán)重的感覺、運(yùn)動(dòng)障礙和智力低下，其發(fā)病時(shí)間、嚴(yán)重程度及開始甲狀腺激素治療的時(shí)間等因素均與腦損害的發(fā)生和恢復(fù)密切相關(guān)。造成胎兒甲狀腺激素缺乏的原因包括妊娠期母體甲狀腺激素的減少如甲狀腺功能減退癥(甲減)、胎兒甲狀腺激素減少如先天性甲狀腺缺如以及因妊娠期碘缺乏導(dǎo)致的母體和胎兒甲狀腺激素均減少。母體臨床甲減

2、及碘缺乏對(duì)胎兒和后代智力的影響已經(jīng)明確。妊娠期母體亞臨床甲減導(dǎo)致后代智力障礙目前已有數(shù)篇報(bào)導(dǎo)。妊娠期母體亞臨床甲減的患病率為2％～3％，如此龐大的女性患病人群存在，提示甲狀腺激素缺乏帶來胎兒第一階段腦發(fā)育影響的普遍性和重要性。但是母體亞臨床甲減對(duì)后代腦發(fā)育影響的機(jī)制研究尚未見報(bào)道。本實(shí)驗(yàn)在成功建立亞臨床甲減孕鼠動(dòng)物模型的基礎(chǔ)上，觀察母鼠亞臨床甲減對(duì)仔鼠行為學(xué)改變的影響，并從腦發(fā)育相關(guān)基因表達(dá)方面探討母體亞臨床甲減導(dǎo)致的胎兒腦發(fā)育障礙的機(jī)

3、制。 方法： 60只SPF級(jí)雌性Wistar大鼠隨機(jī)分成3組(每組n=20)。①正常對(duì)照組：行假手術(shù)、皮下等量注射生理鹽水，作為陰性對(duì)照；②亞臨床甲減組：手術(shù)切除甲狀腺，于背部皮下植入微滲泵(osmotic minipump)，泵中的L-T4以1.0μg/(100g·d)濃度持續(xù)泵入，當(dāng)血清TSH高于正常、但TT4水平在正常范圍時(shí)，提示亞臨床甲減鼠建模成功。十天后與正常的雄鼠合籠交配，雌鼠鏡下陰道涂片發(fā)現(xiàn)精子確定為妊娠0

4、天，記為E0。自E15天后L-T4劑量調(diào)整為1.05μg/(100g·d)持續(xù)泵入至仔鼠生后10d，將分娩當(dāng)日定為P0天；⑧完全甲減組：陽性對(duì)照組、手術(shù)完全切除甲狀腺，皮下等量注射生理鹽水，作為陽性對(duì)照。母鼠于E10、E13、E17、P1時(shí)眶后靜脈叢取血，測(cè)定血清TSH、TT4。仔鼠出生后P3、P7、P21冰上斷頭取海馬組織，以Real-Time PCR方法檢測(cè)BDNF、NCAM mRNA表達(dá)量，以Western blot方法檢測(cè)BDN

5、F、Rapl蛋白表達(dá)量，并與同日齡對(duì)照組比較。仔鼠出生后P35斷頭取腦，以HE染色、尼氏染色方法觀察亞臨床甲減仔鼠腦病理改變及神經(jīng)細(xì)胞形態(tài)學(xué)改變，仔鼠出生后P40行Morris水迷宮行為學(xué)檢測(cè)并與同日齡對(duì)照組比較。應(yīng)用SPSS12.0軟件處理和分析數(shù)據(jù)。 結(jié)果： 1、亞臨床甲減孕鼠模型的制備：孕鼠血清TSH、TT4水平結(jié)果顯示：與假手術(shù)組比較，各孕齡(E10、E13、E17、P1)亞臨床甲減組表現(xiàn)為血清TT4水平未見明顯

6、改變，而TSH水平明顯升高(P<0.05)；與完全甲減組比較，各孕齡亞臨床甲減組表現(xiàn)為血清TT4水平明顯升高，TSH水平明顯降低(P<0.05)，符合亞臨床甲減激素血清學(xué)改變。 2、亞臨床甲減孕鼠后代發(fā)育及激素水平：正常對(duì)照組仔鼠活動(dòng)好，體重增加快，毛發(fā)發(fā)育正常；亞臨床甲減組仔鼠各方面未見明顯異常；甲減組仔鼠睜眼較對(duì)照組遲3～5天，體形偏小，尾短，行動(dòng)遲緩，步態(tài)不穩(wěn)，毛發(fā)出現(xiàn)遲緩且稀疏，體重增加緩慢，明顯低于正常對(duì)照(1日齡P>

7、0.05，21日齡P<0.01)。40日齡進(jìn)行Morris水迷宮測(cè)試時(shí)，亞臨床甲減仔鼠血清激素水平和對(duì)照組無統(tǒng)計(jì)學(xué)差異；完全甲減組仔鼠體重低，血清TT4水平顯著低于同日齡對(duì)照組(P<0.01)，TSH較同日齡對(duì)照明顯升高(P<0.01)。 3、Morris水迷宮行為測(cè)定結(jié)果：定位航行試驗(yàn)中，隨著訓(xùn)練次數(shù)的增加，各組的逃避潛伏期總的趨勢(shì)是不斷縮短，第9次訓(xùn)練結(jié)束，即學(xué)習(xí)訓(xùn)練結(jié)束時(shí)，對(duì)照組逃避潛伏期為18.23±4.27s，亞臨床甲

8、減組為35.63±5.95s，甲減組為55.16±5.15s，組間逃避潛伏期比較有顯著性差異(P<0.05)?？臻g搜索試驗(yàn)中，在P44(撤離平臺(tái)當(dāng)日)時(shí)，正常對(duì)照組仔鼠在靶象限內(nèi)游泳的時(shí)間明顯長(zhǎng)于其它象限，亞臨床甲減組仔鼠在靶象限內(nèi)游泳的時(shí)間也長(zhǎng)于其它象限，與對(duì)照組比較無顯著性差異(P>0.05)，而完全甲減組仔鼠，在各個(gè)象限內(nèi)游泳的時(shí)間差別不明顯，與對(duì)照組比較有顯著性差異(P<0.01)。在P49天(撤離平臺(tái)24h后)，空間探索測(cè)量大

9、鼠的長(zhǎng)時(shí)空間記憶能力實(shí)驗(yàn)中，正常對(duì)照組仔鼠在靶象限內(nèi)游泳的時(shí)間仍明顯長(zhǎng)于其它象限，而亞臨床甲減組仔鼠在靶象限內(nèi)游泳的時(shí)間與其它象限游泳時(shí)間無明顯差異，與對(duì)照組比較有顯著性差異(P<0.05)。完全甲減組后代，在各個(gè)象限內(nèi)游泳的時(shí)間差別仍不明顯，與對(duì)照組比較有顯著性差異(P<0.05)。 4、亞臨床甲減組仔鼠海馬CA1區(qū)HE染色可見神經(jīng)細(xì)胞排列較整齊，層次較清楚，無核固縮，其細(xì)胞形態(tài)同正常對(duì)照組仔鼠相比無明顯差異；亞臨床甲減組仔鼠

10、海馬尼氏小體染色的平均光密度、積分光密度低于正常對(duì)照組(P<0.05)，但是，明顯多于完全甲減組(P<0.01)。 5、用實(shí)時(shí)定量PCR方法測(cè)定海馬組織的BDNF mRNA水平結(jié)果顯示，與正常對(duì)照組仔鼠相比，亞臨床甲減組仔鼠在出生后3d海馬BDNF mRNA表達(dá)量下降約0.73倍，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)，出生后7d、21d海馬BDNF mRNA表達(dá)量與正常對(duì)照組間無顯著差異(P>0.05)；甲減組仔鼠海馬BDNF mR

11、NA表達(dá)量3d、7d和21d均明顯低于亞臨床甲減組和對(duì)照組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.01)。與正常對(duì)照組仔鼠相比，亞甲減組仔鼠在出生后3d、7d及21d海馬NCAM mRNA表達(dá)量有升高的趨勢(shì)，但差異無顯著性(P>0.05)；與亞臨床甲減組和對(duì)照組比較，甲減組仔鼠海馬NCAM mRNA表達(dá)量在3d、7d和21d均明顯升高(P<0.01)。 6、用Western印跡法測(cè)定仔鼠海馬組織的BDNF、Rap1蛋白水平。檢測(cè)結(jié)果顯示，與

12、正常對(duì)照組比較，亞臨床甲減組仔鼠海馬BDNF蛋白表達(dá)量在仔鼠出生后3d、7d明顯降低，降低幅度分別為33％(P<0.01)、29％(P<0.05)。21d時(shí)與正常對(duì)照組差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)；與亞臨床甲減組和對(duì)照組比較，完全甲減組仔鼠海馬BDNF蛋白的表達(dá)量在各時(shí)間點(diǎn)均明顯下降(均P<0.01)。與正常對(duì)照組比較，亞臨床甲減組后代仔鼠海馬內(nèi)Rapl蛋白表達(dá)量在出生后7d時(shí)出現(xiàn)顯著升高，升高幅度為42％(P<0.05)，21d時(shí)

13、繼續(xù)升高，升高幅度為59％(P<0.01)；與亞臨床甲減組和對(duì)照組比較，完全甲減組仔鼠海馬Rap1蛋白的表達(dá)量在3d時(shí)即出現(xiàn)升高，升高幅度為20％(P>0.05)，7d和21d繼續(xù)升高，分別升高42％、58％，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(均P<0.05)。 結(jié)論： 1、通過手術(shù)切除甲狀腺，于背部皮下植入L-T4微滲泵，孕前至E15天L-T4劑量1.0μg/(100g·d)，E15天后L-T4劑量1.05μg/(100g·d)持續(xù)泵

14、入至仔鼠生后10d，能夠成功建立亞臨床甲減孕鼠模型。模型穩(wěn)定，為后部分的研究工作奠定了基礎(chǔ)。 2、妊娠期亞臨床甲減仔鼠出生后P35海馬尼氏小體染色的平均光密度、積分光密度均明顯減少。通過Morris水迷宮的行為學(xué)實(shí)驗(yàn)指標(biāo)，從不同角度驗(yàn)證了不僅母體甲減可以導(dǎo)致后代學(xué)習(xí)記憶能力的減低，母體亞臨床甲減也可以導(dǎo)致仔鼠的空間學(xué)習(xí)記憶能力受損。 3、妊娠期亞臨床甲減孕鼠能引起后代仔鼠出生后早期(P3)大腦海馬DBNF mRNA表達(dá)水