大麻素受體調(diào)節(jié)背根節(jié)神經(jīng)元P2X2,3受體功能參與神經(jīng)病理性疼痛的機(jī)制研究.pdf

1、大麻素作為一種重要的神經(jīng)活性物質(zhì)，參與了機(jī)體多種生理及病理過程的調(diào)節(jié)，廣泛分布于中樞和周圍神經(jīng)組織的大麻素CB1受體（cannabinoid receptor1，CB1R）、CB2受體（cannabinoid receptor2，CB2R）介導(dǎo)了大麻類物質(zhì)的效應(yīng)。以往研究顯示，大麻素類物質(zhì)對(duì)多種病理性疼痛模型動(dòng)物均可產(chǎn)生顯著的鎮(zhèn)痛作用。背根節(jié)（Dorsal root ganglion, DRG)神經(jīng)元為感覺傳入第一級(jí)神經(jīng)元，負(fù)責(zé)接受和初

2、步整合感覺信息并完成初級(jí)感覺信息向脊髓的傳遞。DRG神經(jīng)元興奮性增高是產(chǎn)生病理性疼痛的關(guān)鍵，研究發(fā)現(xiàn)約50％DRG神經(jīng)元表達(dá)CB1R，CB2R低表達(dá)于DRG神經(jīng)元和衛(wèi)星細(xì)胞。此外，嘌呤能P2X1-6受體在DRG神經(jīng)元均有表達(dá)，尤其是P2X3受體選擇性表達(dá)于與傷害性感受密切相關(guān)的中小型DRG神經(jīng)元。以往研究顯示P2X受體的功能受到PKA的調(diào)節(jié)，而大麻素受體激活可以改變cAMP-PKA活性，大麻素受體能否調(diào)節(jié)P2X受體功能而改變初級(jí)感覺神經(jīng)

3、元的興奮性，間接發(fā)揮鎮(zhèn)痛作用，目前尚不清楚。通過制作大鼠坐骨神經(jīng)慢性縮窄性損傷（chronic constriction injury of sciatic nerve, CCI）模型，結(jié)合在體和離體研究，觀察：大麻素類物質(zhì)CP55940對(duì) CCI所致的神經(jīng)痛大鼠的鎮(zhèn)痛作用以及對(duì)背根節(jié) P2X受體表達(dá)的影響；CP55940對(duì)培養(yǎng)的DRG神經(jīng)元P2X受體功能的影響。
　　目的：⑴觀察大麻素受體在神經(jīng)病理性疼痛中的作用，及其對(duì)P2X受

4、體表達(dá)的影響。⑵觀察大麻素類物質(zhì) CP55940對(duì)培養(yǎng)的背根節(jié)神經(jīng)元 P2X受體激活所致的[Ca2+]i變化的影響。
　　方法：①實(shí)驗(yàn)分組：7～8w成年SD大鼠（雄性）50只分為5組：sham組(假手術(shù)組，n=10)；CCI組(鞘內(nèi)注射DMSO+生理鹽水，n=10)；CP55940+CCI組(鞘內(nèi)注射0.05 mg/kg CP55940，n=10)；AM251+CP55940+CCI組（預(yù)先鞘內(nèi)注射0.05 mg/kg AM251

5、，15 min后給予0.05 mg/kg CP55940，n=10）；AM630+ CP55940+ CCI組(預(yù)先鞘內(nèi)注射0.05mg/kg AM630,15 min后給予0.05 mg/kg CP55940，n=10)。行為學(xué)檢測(cè)：熱刺激縮足反射潛伏期（Paw withdrawal thermal latency, PWTL）、機(jī)械縮足反射閾值（Paw withdrawal mechanical threshold, PWMT）測(cè)定

6、。免疫印跡技術(shù)檢測(cè)：CB1R、CB2R、P2X2R、P2X3R蛋白表達(dá)水平。②離體實(shí)驗(yàn)：培養(yǎng)2~3w SD幼鼠 DRG神經(jīng)元分為7組：ATP（100μmol/L）組；EGTA+ATP（100μmol/L）組，EGTA預(yù)孵育20 min，給予 ATP；TNP-ATP(10μmol/L）+ATP（100μmol/L）組，TNP-ATP預(yù)孵育10 min，給予 ATP；CP55940(0.001、0.01、0.1、1μmol/L）+ATP（1

7、00μmol/L）組，CP55940預(yù)孵育10 min，給予 ATP；AM251（10μmol/L）+CP55940（1μmol/L）+ATP（100μmol/L）組，AM251預(yù)孵育10 min后加 CP55940孵育10 min，給予 ATP；AM630（10μmol/L）+CP55940（1μmol/L）+ATP（100μmol/L）組，AM630預(yù)孵育10 min后加 CP55940孵育10min，給予 ATP；Fsk（10μm

8、ol/L）+CP55940（1μmol/L）+ATP（100μmol/L）組，F(xiàn)sk與 CP55940預(yù)孵育10 min，給予 ATP。應(yīng)用激光共聚焦技術(shù)檢測(cè)各實(shí)驗(yàn)組 DRG神經(jīng)元[Ca2+]i的變化。
　　結(jié)果：⑴大鼠CCI術(shù)后1d即形成穩(wěn)定的熱痛敏、機(jī)械痛敏，直到第14d PWTL、PWMT仍明顯縮短（P<0.05）；鞘內(nèi)注射大麻素受體激動(dòng)劑CP55940（0.05 mg/kg）可明顯延長CCI大鼠PWTL和PWMT（P<0.

9、05）；CB1R拮抗劑AM251(0.05 mg/kg)、CB2R拮抗劑AM630(0.05 mg/kg)均可顯著逆轉(zhuǎn)CP55940的鎮(zhèn)痛效應(yīng)。免疫印跡結(jié)果說明， CCI術(shù)后7、14d大鼠術(shù)側(cè)背根節(jié)CB1R、CB2R、P2X2R、P2X3R表達(dá)明顯增加（P<0.05）；鞘內(nèi)給予CP55940顯著降低了CCI大鼠背根節(jié)CB1R、CB2R、P2X2R、P2X3R的表達(dá)（P<0.05）；AM251、AM630均可顯著逆轉(zhuǎn)CP55940的抑制效

10、應(yīng)（P<0.05）。⑵100μmol/L ATP可誘發(fā)培養(yǎng)的背根節(jié)神經(jīng)元[Ca2+]i增高；用 EGTA螯合胞外 Ca2+可基本阻斷 ATP導(dǎo)致的[Ca2+]i升高；此外，P2X受體拮抗劑 TNP-ATP(10μmol/L)預(yù)孵育10 min可顯著抑制 ATP誘發(fā)的[Ca2+]i升高（P<0.05）；大麻素受體激動(dòng)劑 CP55940(1μmol/L)預(yù)孵育10 min可劑量依賴性地抑制背根節(jié)神經(jīng)元ATP所致的[Ca2+]i升高（P<0.

11、05）；CB1R拮抗劑 AM251(10μmol/L)、CB2R拮抗劑 AM630(10μmol/L)均可顯著逆轉(zhuǎn) CP55940的抑制效應(yīng)（P<0.05）；腺苷酸環(huán)化酶激動(dòng)劑 Forskolin（10μmol/L）可消除 CP55940對(duì) ATP的抑制作用（P<0.05）。
　　結(jié)論：①背根節(jié)大麻素受體的激活對(duì)CCI所致的神經(jīng)病理性疼痛具有良好的鎮(zhèn)痛作用，同時(shí)可降低CCI大鼠嘌呤能P2X2,3受體的表達(dá)。②CP55940可顯著抑