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文檔簡介
1、神經(jīng)病理性疼痛是臨床頑癥之一,長期困擾患者并嚴(yán)重影響其生活質(zhì)量。脊髓背角是機體對傷害性信息進(jìn)行自身調(diào)制或整合的重要位點。它不僅是神經(jīng)活性物質(zhì)和受體分布最多和含量最豐富的部位,也是痛、觸、溫覺神經(jīng)元主要分布的區(qū)域之一。研究脊髓背角部位疼痛相關(guān)的調(diào)控因子有助于了解神經(jīng)病理性疼痛發(fā)生和維持的機制。以往大量研究表明脊髓小膠質(zhì)細(xì)胞的激活是神經(jīng)病理性疼痛產(chǎn)生和持續(xù)的關(guān)鍵因素,但目前對于其活化的分子和細(xì)胞機理尚需深入探討。
三磷酸腺苷(Ad
2、enosine triphosphate,ATP)是參與脊髓水平傷害性信息調(diào)制的一種重要的遞質(zhì)。ATP通過P2嘌呤受體在中樞神經(jīng)系統(tǒng)中發(fā)揮其重要作用,其中包括7種離子通道型P2X受體和9種G-蛋白偶聯(lián)P2Y受體。P2X7受體是P2X家族中一個獨特的亞型,研究表明其可能參與了痛覺信息的調(diào)制和傳導(dǎo)。P2X7受體在中樞神經(jīng)系統(tǒng)分布廣泛,包括小膠質(zhì)細(xì)胞在內(nèi)的多種神經(jīng)細(xì)胞上均有其功能性受體的表達(dá)。外周神經(jīng)損傷后,損傷組織細(xì)胞和感覺神經(jīng)末梢釋放大量
3、ATP,研究表明ATP可以激活小膠質(zhì)細(xì)胞,誘導(dǎo)小膠質(zhì)細(xì)胞聚集、增生,并促進(jìn)其釋放多種前炎癥因子和神經(jīng)活性物質(zhì)。但是P2X7受體是否介導(dǎo)脊髓背角部位小膠質(zhì)細(xì)胞的激活,參與神經(jīng)病理性疼痛的發(fā)生和持續(xù)過程目前尚不清楚。
本項目擬采用體外培養(yǎng)的小膠質(zhì)細(xì)胞和坐骨神經(jīng)慢性壓迫損傷(chronic constriction of the sciatic nerve injury,CCI)大鼠模型為研究對象,結(jié)合在體及離體實驗,綜合應(yīng)用形態(tài)學(xué)
4、、分子生物學(xué)和行為學(xué)等多種技術(shù)方法,觀察P2X7受體激活對小膠質(zhì)細(xì)胞的細(xì)胞內(nèi)游離Ca2+濃度(the intracellular concentration of Ca2+,[Ca2+]i)和D-絲氨酸(D-Serine,D-Ser)等氨基酸的釋放的影響,初步探討P2X7受體激活與小膠質(zhì)細(xì)胞活化的關(guān)系及其調(diào)控機制;觀察CCI模型中脊髓背角部位小膠質(zhì)細(xì)胞激活與P2X7受體表達(dá)變化的規(guī)律及關(guān)系,證實P2X7受體介導(dǎo)小膠質(zhì)細(xì)胞活化參與神經(jīng)病理
5、性疼痛。該研究對闡明神經(jīng)病理性疼痛的機制具有重要意義。
方法:
體外培養(yǎng)BV-2小膠質(zhì)細(xì)胞,免疫熒光標(biāo)記技術(shù)觀察BV-2小膠質(zhì)細(xì)胞CD11b、P2X7受體和絲氨酸消旋酶(Serine racemase,SR)的表達(dá);免疫組織化學(xué)染色觀察ATP、BzATP作用后BV-2小膠質(zhì)細(xì)胞CD11b、SR表達(dá)的變化;激光共聚焦掃描顯微鏡(Confocal laser scanning microscopy,CLSM)觀察ATP、
6、BzATP作用下BV-小膠質(zhì)細(xì)胞[Ca2+]i變化;應(yīng)用高效液相色譜技術(shù)(High Performance Liquid Chromatography,HPLC)觀察ATP、BzATP作用下BV-2小膠質(zhì)細(xì)胞D-Ser等氨基酸類遞質(zhì)的釋放;制備坐骨神經(jīng)慢性壓迫損傷模型(,免疫組織化學(xué)染色和免疫印跡技術(shù)(Western blotting)觀察脊髓背角P2X7受體表達(dá)變化;免疫熒光雙重標(biāo)記技術(shù)對脊髓P2X7受體表達(dá)進(jìn)行細(xì)胞定位;制備鞘內(nèi)插管
7、后的CCI大鼠模型,鞘內(nèi)給予P2X7受體特異性拮抗劑亮藍(lán)G(Brilliant blue G,BBG)后,免疫組織化學(xué)染色觀察脊髓背角小膠質(zhì)細(xì)胞活化和OX42表達(dá)變化;熱輻射法和Von Frey(vFh)纖維絲測痛檢測大鼠熱痛閾和機械性痛閾的變化。
結(jié)果:
第一部分:
1.培養(yǎng)的BV-2小膠質(zhì)細(xì)胞,免疫熒光標(biāo)記鑒定其CD11b陽性率>99%,符合實驗要求。免疫熒光雙重標(biāo)記表明小膠質(zhì)細(xì)胞表達(dá)P2X7受體蛋白,
8、其陽性呈細(xì)小顆粒狀,主要分布于小膠質(zhì)細(xì)胞的胞膜和胞漿內(nèi)。
2.0.1μmol/L和1μmol/L的ATP并不能引起小膠質(zhì)細(xì)胞[Ca2+]i升高,10μmol/L ATP才可引起小膠質(zhì)細(xì)胞[Ca2+]i升高,而1μmol/L的BzATP即可引起小膠質(zhì)細(xì)胞[Ca2+]i升高,而且隨著濃度的升高ATP和BzATP誘發(fā)的[Ca2+]i更為明顯,存在一定的劑量依賴關(guān)系。100μmol/L ATP、BzATP均則可引起小膠質(zhì)細(xì)胞[Ca2+
9、]i顯著的升高;而且BzATP誘發(fā)的[Ca2+]i濃度升高要比ATP誘發(fā)的[Ca2+]i濃度升高更為持久。
3.100μmol/L ATP、BzATP作用于小膠質(zhì)細(xì)胞可促進(jìn)其[Ca2+]i升高,而在預(yù)孵育P2X7特異性阻斷劑BBG(100nmol/L)20min后ATP、BzATP誘發(fā)的小膠質(zhì)細(xì)胞[Ca2+]i反應(yīng)完全被抑制。
4.將細(xì)胞培養(yǎng)液更換為無鈣液預(yù)孵育20min后,100μmol/L BzATP誘發(fā)小膠質(zhì)細(xì)
10、胞[Ca2+]i升高被抑制。
5.100μmol/L ATP、BzATP作用于小膠質(zhì)細(xì)胞24h后可以促進(jìn)其活化標(biāo)記物CD11b表達(dá)明顯升高,而預(yù)孵育BBG可以抑制這一表達(dá)上調(diào)效應(yīng)。
第二部分:
1.100μmol/L ATP、BzATP作用于小膠質(zhì)細(xì)胞10min后培養(yǎng)液中甘氨酸(Glycine,Gly)濃度顯著增加,但天冬氨酸(Aspartic acid,Asp)和谷氨酸(Glutamate;Glu)濃度未
11、見明顯變化。預(yù)孵育BBG20min后,再加入ATP、BzATP作用于小膠質(zhì)細(xì)胞10min后培養(yǎng)液Gly濃度與PBS對照組未見明顯變化。
2.在移除了細(xì)胞外Ca2+后,100μmol/L BzATP作用于小膠質(zhì)細(xì)胞10min后,其培養(yǎng)液Gly濃度與未移除細(xì)胞外Ca2+沒有明顯變化。預(yù)孵育100μmol/L蛋白激酶C(protein kinase C,PKC)阻斷劑白屈菜紅堿(Chelerythrine chloride,Che)
12、后再加入BzATP,其培養(yǎng)液Gly濃度與未孵育Che時相比有所降低,但仍要高于PBS對照組。而預(yù)孵育100μmol/L蛋白激酶A(protein kinase A,PKA)阻斷劑H-89后再加入BzATP,其培養(yǎng)液Gly濃度與未孵育H-89時未有明顯變化。
3.100μmol/L ATP、BzATP短時間(10min)作用于小膠質(zhì)細(xì)胞,其培養(yǎng)液中D-Ser未見明顯變化,但較長時間作用(24h)后小膠質(zhì)細(xì)胞的培養(yǎng)液中D-Ser濃
13、度顯著增加,表明其D-Ser濃度增加可能與D-Ser合成有關(guān);預(yù)孵育BBG20min后再加入ATP、BzATP作用小膠質(zhì)細(xì)胞24h后培養(yǎng)液中D-Ser濃度明顯降低,與PBS組相比沒有顯著差異。
4.在移除了細(xì)胞外Ca2+后,100μmol/L BzATP作用于小膠質(zhì)細(xì)胞24h后,其培養(yǎng)液D-Ser濃度與未移除細(xì)胞外Ca2+時相比有所降低,但仍要高于PBS對照組。預(yù)孵育100μmol/L Che后再加入BzATP,其培養(yǎng)液D-S
14、er濃度與未孵育Che時相比有所降低,但仍要高于PBS對照組。而預(yù)孵育100μmol/L H-89后再加入BzATP,其培養(yǎng)液Gly濃度與未孵育D-Ser時未有明顯變化。
5.免疫熒光雙重標(biāo)記表明小膠質(zhì)細(xì)胞上有SR的表達(dá),且大部分在小膠質(zhì)細(xì)胞上與P2X7受體共表達(dá);100μmol/L ATP、BzATP刺激小膠質(zhì)細(xì)胞可促進(jìn)SR表達(dá)升高,這一效應(yīng)可在預(yù)孵育BBG后被抑制。
第三部分:
1.成功制備了大鼠坐骨神
15、經(jīng)慢性壓迫(CCI)模型,動物表現(xiàn)出典型的神經(jīng)病理性疼痛相關(guān)痛行為,且CCI大鼠術(shù)后機械性痛閾和熱痛閾均降低,于14d達(dá)到最低,與正常對照大鼠和假性手術(shù)大鼠具有顯著性差異。正常對照組大鼠及假性手術(shù)組大鼠的機械痛閾和熱痛閾在整個觀察周期內(nèi)也相對穩(wěn)定,未出現(xiàn)顯著變化。
2.免疫組織化學(xué)和Western blotting結(jié)果顯示大鼠CCI術(shù)后,其脊髓背角P2X7受體表達(dá)顯著增加,14d達(dá)到峰值,21d仍高于正常對照和假性手術(shù)組大鼠;
16、其表達(dá)的變化趨勢在時程上與大鼠熱痛閾和機械痛閾的變化趨勢表現(xiàn)一致。此外,P2X7受體表達(dá)的增加主要集中于與痛覺信息密切相關(guān)的I-IV層。
3.免疫熒光雙重標(biāo)記結(jié)果顯示P2X7受體陽性細(xì)胞同時也表現(xiàn)為小膠質(zhì)細(xì)胞特異性標(biāo)記物CD11b(OX42)陽性,而其陽性結(jié)果并不與星形膠質(zhì)細(xì)胞特異性標(biāo)志物膠質(zhì)纖維酸性蛋白(Glial fibrillary acidic protein,GFAP)和神經(jīng)元特異性標(biāo)記物微管相關(guān)蛋白2(Microt
17、ubule-associated protein2,MAP2)陽性結(jié)果重疊。
4.鞘內(nèi)給予0.9%NaCl的CCI大鼠其損傷同側(cè)后肢機械痛閾和熱痛閾變化趨勢與之前未給藥的CCI大鼠基本一致,3d時即表現(xiàn)為顯著下降,14d達(dá)到峰值,直至21d依然低于正常水平。給予BBG的CCI大鼠其損傷同側(cè)后肢熱痛閾CCI術(shù)后3d也表現(xiàn)為降低,14d時達(dá)到峰值,21d仍未完全恢復(fù),但要高于同一時間節(jié)點的給予0.9%NaCl的CCI組大鼠和未給藥
18、的CCI大鼠,且差異具有統(tǒng)計學(xué)意義。
5.免疫組化結(jié)果顯示,大鼠CCI術(shù)后其損傷同側(cè)脊髓背角OX42表達(dá)3d時即顯著增加,14d達(dá)到峰值,高水平的OX42表達(dá)一直持續(xù)至21d。鞘內(nèi)給予CCI大鼠BBG14d后,其脊髓背角OX42的表達(dá)較同一時間節(jié)點的給予0.9%NaCl組和未給藥的CCI大鼠相比明顯減少,但仍高于正常對照組大鼠,且具有顯著性差異。而且CCI術(shù)后14d和鞘內(nèi)給予生理鹽水的CCI組其脊髓背角小膠質(zhì)細(xì)胞胞體明顯變大,
19、突起變短,呈現(xiàn)明顯的活化狀態(tài),鞘內(nèi)給予BBG的CCI大鼠小膠質(zhì)細(xì)胞胞體和突起雖然也出現(xiàn)相應(yīng)變化,但活化程度不如CCI組和給予生理鹽水組的明顯。
結(jié)論:
1.P2X7受體表達(dá)于培養(yǎng)的BV-2小膠質(zhì)細(xì)胞上,且參與介導(dǎo)BV-2小膠質(zhì)細(xì)胞活化;2.ATP、BzATP激活P2X7受體后誘發(fā)小膠質(zhì)細(xì)胞[Ca2+]i升高;此效應(yīng)可能與細(xì)胞外Ca2+大量內(nèi)流有關(guān);
3.ATP、BzATP可促進(jìn)小膠質(zhì)細(xì)胞釋放Gly,但不影響
20、Asp和Glu的釋放。這一效應(yīng)是由P2X7受體參與介導(dǎo),并受到PKC的調(diào)控,而與細(xì)胞外Ca2+濃度和PKA無關(guān);
4.ATP、BzATP激活P2X7受體后誘發(fā)小膠質(zhì)細(xì)胞中D-Ser合成、釋放增加升高,這一效應(yīng)受到細(xì)胞外Ca2+濃度和PKC的調(diào)控,但與PKA無關(guān)
5.培養(yǎng)的BV-2小膠質(zhì)細(xì)胞上有SR表達(dá)。ATP、BzATP通過P2X7受體途徑可促進(jìn)小膠質(zhì)細(xì)胞上SR的表達(dá),可能是ATP、BzATP誘發(fā)小膠質(zhì)細(xì)胞中D-Se
21、r合成、釋放增加的作用機制。
6.大鼠脊髓背角P2X7受體特異地表達(dá)于小膠質(zhì)細(xì)胞,并在神經(jīng)病理性疼痛模型中表達(dá)增加,促進(jìn)了CCI術(shù)后脊髓背角小膠質(zhì)細(xì)胞的活化,并與神經(jīng)病理性疼痛條件下熱痛敏和機械性痛敏的發(fā)生、持續(xù)密切相關(guān)。
綜上所述,脊髓背角P2X7受體特異性的表達(dá)于小膠質(zhì)細(xì)胞,在神經(jīng)病理性疼痛模型中表達(dá)升高,參與介導(dǎo)神經(jīng)病理性疼痛下脊髓小膠質(zhì)細(xì)胞活化,并可能通過促進(jìn)小膠質(zhì)細(xì)胞釋放Gly、D-Ser等氨基酸類遞質(zhì)釋放
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