P2Y12受體在脊髓水平參與神經(jīng)病理性疼痛的初步研究.pdf

1、隨著“嘌呤神經(jīng)能”概念的提出，嘌呤作為一種神經(jīng)遞質(zhì)逐漸被人們所認(rèn)識，而嘌呤受體作為傳導(dǎo)接受嘌呤能信息的物質(zhì)也越來越受到學(xué)者們的重視。P2Y12受體是屬于嘌呤受體中的P2Y（G蛋白偶聯(lián)受體）中的一個亞型，已經(jīng)廣泛應(yīng)用于血管性疾病的治療研究.有研究證實(shí)，P2Y12受體是通過參與血小板的聚集活動在血管性疾病治療過程中發(fā)揮著有效的作用。P2Y12受體在病理性疼痛作用中的機(jī)制，目前卻并未闡明。脊髓是疼痛的重要整合區(qū)域，疼痛信息，通過初級傳入纖維傳

2、入脊髓背角進(jìn)行信息整合后再傳入到大腦皮層。脊髓背角中有大量的神經(jīng)元，以及神經(jīng)膠質(zhì)細(xì)胞。過去一直認(rèn)為在中樞神經(jīng)系統(tǒng)中膠質(zhì)細(xì)胞僅僅有營養(yǎng)，支持和絕緣的功能。然而近年來，隨著技術(shù)的發(fā)展和研究的深入，學(xué)者們發(fā)現(xiàn)，膠質(zhì)細(xì)胞在脊髓背角疼痛的產(chǎn)生和發(fā)展中也有非常重要的位子，特別是小膠質(zhì)細(xì)胞在病理性疼痛的初始階段即發(fā)揮作用。大量研究顯示，P2Y12受體拮抗劑對病理性疼痛的緩解有一定的作用。與此同時，P2Y12受體選擇性的表達(dá)于脊髓背角小膠質(zhì)細(xì)胞。P2Y

3、l2受體是否通過小膠質(zhì)細(xì)胞來參與病理性疼痛的機(jī)制，目前并不清楚。
　　 目的:觀察脊髓背角P2Y12受體在神經(jīng)病理性疼痛的過程中的作用;探討P2Y受體在脊髓背角小膠質(zhì)細(xì)胞活性調(diào)節(jié)中的作用及相應(yīng)的胞內(nèi)信號傳導(dǎo)機(jī)制。
　　 方法:實(shí)驗(yàn)所用動物購置于第三軍醫(yī)大學(xué)實(shí)驗(yàn)動物中心。
　　 (1).健康成年雄性SD大鼠40只，體質(zhì)量200～250 g，購自第三軍醫(yī)大學(xué)實(shí)驗(yàn)動物中心[許可證號SCXK（渝）2007-0005]。大

4、鼠在適應(yīng)環(huán)境l周后隨機(jī)平均分五組:假手術(shù)組（A組）、CCI模型組（鞘內(nèi)注射生理鹽水，B組）、 CCI+鞘內(nèi)注射MRS2395 lpmol/1組（C組）;CCI+鞘內(nèi)注射MRS239510pmol/1組（D組）;CCI+鞘內(nèi)注射MRS2395100pmoH組（E組）。A組大鼠僅暴露坐骨神經(jīng)不進(jìn)行結(jié)扎。其余大鼠在鞘內(nèi)置管5d后進(jìn)行坐骨神經(jīng)結(jié)扎，術(shù)后分別給予0.005％DMSO生理鹽水或不同濃度MRS2395。
　　 (2).培養(yǎng)并純

5、化脊髓背角小膠質(zhì)細(xì)胞，分別采用激光共聚焦技術(shù)和免疫組織化學(xué)染色方法觀察P2Y受體激活后小膠質(zhì)細(xì)胞[Ca2+]i的變化和Ibal表達(dá)變化。
　　 結(jié)果:(1)大鼠CCI術(shù)后1天即形成穩(wěn)定的熱痛敏。A組沒有出現(xiàn)神經(jīng)痛表現(xiàn)。B組術(shù)后出現(xiàn)結(jié)扎側(cè)患足足趾并攏背屈、舔舐、懸空等神經(jīng)痛表現(xiàn)，但無運(yùn)動功能障礙。C、D、E組大鼠結(jié)扎側(cè)后足的足趾背屈、舔舐、懸空等自發(fā)神經(jīng)痛行為有所減輕。與給藥前相比，術(shù)后第1天C、D、E組給藥后30min未有明顯改

6、變，而lh TWL明顯延長(P＜0.05);給藥后2、3h TWL逐漸縮短。這表明MRS2395發(fā)揮鎮(zhèn)痛效應(yīng)在注射MRS2395后lh達(dá)高峰。與A組相比，B組大鼠在術(shù)后1天出現(xiàn)TWL縮短(P＜0.05)，隨著鞘內(nèi)注射MRS2395劑量的增加， TWL延長更為明顯。在術(shù)后1-7d內(nèi)，C、D、E組TWL明顯延長(P＜0.05)，但在7天之后，TWL延長逐漸降低。在A組脊髓背角，Ibal陽性細(xì)胞呈微量散在表達(dá)，細(xì)胞形態(tài)清晰，胞體較小，具有多個

7、伸向各個方向的細(xì)長突起。與A組相比，B組大鼠在術(shù)后7天和14天，Ibal陽性細(xì)胞個數(shù)明顯增加，細(xì)胞深染，胞體增大，突起增粗變長，其平均光密度值明顯增加(P＜0.05)。與B組相比，在C、D、E組，CCI術(shù)后7天和14天脊髓背角Ibal陽性細(xì)胞數(shù)目明顯減少，其平均光密度值明顯降低(P＜0.05).
　　 (2)倒置相差顯微鏡下見原代培養(yǎng)的背角小膠質(zhì)細(xì)胞，胞體較大，可見多個長短不一的纖細(xì)突起，呈蜘蛛樣。Ibal陽性細(xì)胞為小膠質(zhì)細(xì)胞，

8、用免疫化學(xué)方法鑒定培養(yǎng)的細(xì)胞中Ibal免疫反應(yīng)陽性率＞90％，表明培養(yǎng)的小膠質(zhì)細(xì)胞符合實(shí)驗(yàn)要求。與靜息狀態(tài)下小膠質(zhì)細(xì)胞鈣熒光強(qiáng)度值相比，0.01μ M2-mesADP可以誘發(fā)小膠質(zhì)細(xì)胞Ca>熒光強(qiáng)度輕度升高，但不具有統(tǒng)計學(xué)意義;0.1～100 u M2-mesADP可以以劑量依賴的方式誘發(fā)小膠質(zhì)細(xì)胞Ca2+熒光強(qiáng)度逐步升高，具有統(tǒng)計學(xué)意義(P＜0.001);100u M2-mesADP誘發(fā)小膠質(zhì)細(xì)胞[Ca2+]i明顯升高，具有統(tǒng)計學(xué)意義