背根神經節(jié)TRESK參與神經病理性疼痛的作用研究.pdf

1、一、研究背景
　　 背根神經節(jié)在神經病理性疼痛的發(fā)病機制中起著重要作用。許多研究證明背根神經節(jié)的多種鉀離子通道亞型的變化是神經病理性疼痛發(fā)生、發(fā)展的必要條件。TRESK，編碼KCNK18基因，是近年來新發(fā)現的一個雙孔鉀離子通道亞型，在背根神經節(jié)中大量表達。其主要功能是維持神經元細胞的靜息電位，在神經元細胞興奮過程中起著重要作用。越來越多的研究證明了TRESK可能參與各型疼痛的發(fā)生過程，但目前并未有關于背根神經節(jié)的TRESK參與神

2、經病理性疼痛的研究。
　　 二、目的
　　 本研究首先觀察坐骨神經分支選擇性損傷誘發(fā)神經病理性疼痛的大鼠模型中背根神經節(jié)TRESKmRNA的變化。在成功構建了TRESK基因重組腺病毒載體后，轉染背根神經節(jié)神經元細胞，驗證其轉染和上調TRESKmRNA的效率，并研究TRESK基因上調對背根神經節(jié)細胞P物質釋放的影響。另外，對坐骨神經分支選擇性損傷誘發(fā)神經病理性疼痛大鼠鞘內注射TRESK基因重組腺病毒載體，驗證其在體上調大鼠

3、背根神經節(jié)TRESKmRNA和蛋白的效果，并觀察此變化對神經病理性疼痛大鼠痛閾的影響以及對脊髓膠質細胞激活程度的影響。探討背根神經節(jié)的TRESK在神經病理性疼痛中的作用。
　　 三、方法
　　 實驗分四部分：
　　 1.雄性SD大鼠32只，隨機分為2組，假手術組（Shame組，n=16）和坐骨神經分支選擇性損傷組（SNI組，n=16）。兩組大鼠各取8只術前1d處死，取L4,5術側的DRG，realtime PCR

4、檢測TRESKmRNA表達；各組余下8只大鼠分別與術前1d及術后1、3、5、7、14d分別測定機械痛閾和熱痛閾，術后14d處死，realtime PCR檢測L4,5術側DRG的TRESKmRNA表達。
　　 2.從大鼠背根神經節(jié)細胞中克隆TRESK全長cDNA，PCR鑒定及DNA測序驗證；
　　 構建以CMV啟動子轉錄調控的pAd/CMV/V5-DEST-TRESK。轉化DH5α大腸桿菌，挑取陽性重組克隆行PCR鑒定、酶

5、切鑒定后，再取陽性克隆后行DNA測序。將測序正確的質粒經PacI酶切線性化，轉染包裝293T細胞，包裝產生TRESK基因重組的腺病毒載體，逐孔稀釋滴度法測定病毒滴度。
　　 3.原代培養(yǎng)大鼠背根神經節(jié)細胞，隨機分為6組，每組9孔。對照組(C組)：不行任何處理；辣椒素組（S組）：300nmol/L辣椒素的新鮮培養(yǎng)液孵育10min；陰性對照組(NC組)：每孔加入3×109個陰性對照腺病毒；陰性對照+辣椒素組(NCS組)：每孔加入3×

6、109陰性對照腺病毒，72h后，300nmol/L辣椒素的新鮮培養(yǎng)液孵育10min；TRESK基因重組腺病毒組（R組）：每孔中加入3×109個TRESK基因重組腺病毒pAd/CMV/V5-DEST-TRESK；TRESK基因重組腺病毒+辣椒素組(RS組)：每孔中加入3×109個TRESK基因重組腺病毒pAd/CMV/V5-DEST-TRESK，72h后，300nmol/L辣椒素的新鮮培養(yǎng)液孵育10min。
　　 各組于48h后采

7、用realtime PCR檢測TRESKmRNA表達；72h后分別用Westernblot法和放射免疫分析法檢測TRESK蛋白和SP的釋放。
　　 4.雄性SD大鼠108只，隨機分為6組(n=18)：Ⅰ組為空白對照組；Ⅱ組為假手術組；Ⅲ組制備坐骨神經分支選擇性損傷（SNI）大鼠模型；Ⅳ組制備SNI大鼠模型后再鞘內注射生理鹽水；Ⅴ組制備SNI大鼠模型后再鞘內注射陰性腺病毒；Ⅵ組制備SNI大鼠模型后再鞘內注射TRESK基因重組腺病毒

8、pAd/CMV/V5-DEST-TRESK。
　　 各組分別與術前1d及術后1、3、5、7、14d分別測定機械痛閾和熱痛閾。術后14d處死，取L4,5術側DRG，每組6只realtime PCR檢測L4,5術側DRG的TRESKmRNA表達，再取6只檢測L4,5術側DRG的TRESK蛋白表達，剩余6只大鼠取L4,5脊髓，免疫組織化學觀察脊髓膠質細胞的激活程度。
　　 四、結果
　　 1.SNI組術后1～14d時的

9、機械痛閾明顯低于Shame組，SNI組術后14d術側L4,5DRG的TRESKmRNA表達明顯低于Shame組；與術前組內比較，SNI組術后1～14d時的MWT明顯降低，SNI組術后14d術側L4,5DRG的TRESKmRNA表達明顯降低。
　　 2.從大鼠DRG細胞中克隆的TRESK全長cDNA為781bp，DNA測序驗證DNA序列與GeneBank中收錄的大鼠TRESK序列完全一致。以pAD-GFP空載體為對照，pAD/CM

10、V/V5-DEST-TRESK gDNA為模板的PCR擴增，目的片段781bp，鑒定結果與預期相符。腺病毒滴度為1.31×109TU／m1。
　　 3.與C組比較，R組、RS組大鼠DRG細胞的TRESKmRNA表達水平均明顯升高，S組、NCS組大鼠DRG細胞的TRESKmRNA表達水平均明顯降低。與C組比較，R組、RS組大鼠DRG細胞的TRESK蛋白表達水平均明顯增高；S組、NCS組大鼠DRG細胞的TRESK蛋白表達水平均明顯降

11、低。與C組比較，S組、NCS組、RS組大鼠DRG細胞的SP水平均明顯增高；S組、NCS組大鼠DRG細胞的SP水平均明顯高于RS組。
　　 4.Ⅲ組、Ⅳ組、Ⅴ組、Ⅵ組術后1～14d時的機械痛閾明顯低于Ⅰ組，Ⅲ組、Ⅳ組、Ⅴ組5、7、14d時的機械痛閾明顯低于Ⅵ組；與術前比較，Ⅲ組、Ⅳ組、Ⅴ組、Ⅵ組術后1～14d時的機械痛閾明顯降低。Ⅲ組、Ⅳ組、Ⅴ組、Ⅵ組L4,5術側DRG的TRESKmRNA表達明顯低于Ⅰ組，Ⅵ組L4,5術側DRG的

12、TRESKmRNA表達明顯高于Ⅲ組、Ⅳ組、Ⅴ組。Ⅲ組、Ⅳ組、Ⅴ組、Ⅵ組L4,5術側DRG的TRESK蛋白表達明顯低于Ⅰ組，Ⅵ組L4,5術側DRG的TRESK蛋白表達明顯高于Ⅲ組、Ⅳ組、Ⅴ組。Ⅲ組、Ⅳ組、Ⅴ組、Ⅵ組脊髓膠質細胞激活明顯高于Ⅰ組；Ⅵ組脊髓膠質細胞激活明顯低于Ⅲ組、Ⅳ組、Ⅴ組。
　　 五、結論
　　 1.神經病理性疼痛會導致背根神經節(jié)的TRESKmRNA下調，神經病理性疼痛的發(fā)生、發(fā)展可能與背根神經節(jié)的TRES

13、K 密切相關。
　　 2.成功克隆了大鼠TRESK全長cDNA，并構建其重組腺病毒表達載體：pAD/CMV/V5-DEST-TRESK，腺病毒滴度為1.31×109TU／m1。
　　 3.TRESK基因重組腺病毒載體pAd/CMV/V5-DEST-TRESK可有效地上調大鼠原代背根神經節(jié)細胞TRESKmRNA及其蛋白的表達；TRESK基因上調可抑制辣椒素誘發(fā)的大鼠背根神經節(jié)細胞P物質的釋放。
　　 4.鞘內注射T