白藜蘆醇通過(guò)膽堿能系統(tǒng)改善頸動(dòng)脈狹窄閉塞大鼠受損的認(rèn)知功能.pdf

1、目的:
　　對(duì)于頸動(dòng)脈狹窄(carotid artery stenosis，CAS)導(dǎo)致血管性認(rèn)知功能障礙(vascular cognitive impairment，VCT)的機(jī)制及如何預(yù)防和治療，成為越來(lái)越多研究者的研究熱點(diǎn)。流行病學(xué)調(diào)查和較多研究都提示:頸動(dòng)脈狹窄的病人往往容易發(fā)生認(rèn)知能力的損害。而其中病情較重的部分病人，甚至?xí)泻芨叩陌l(fā)生癡呆的風(fēng)險(xiǎn)。
　　研究發(fā)現(xiàn)，法國(guó)人同其它歐美國(guó)家地區(qū)人群一樣，都有著罹患冠心病的

2、高風(fēng)險(xiǎn)，如:高脂食物的大量食用、血液高甘油三酯水平、高血壓病以及大量吸煙等。但無(wú)論是法國(guó)人的罹患冠心病的比率，還是他的死亡率，都比其他歐美國(guó)家和地區(qū)明顯要低，而這一情況被稱之為“法蘭西悖論”(French Paradox)。而這一現(xiàn)象的原因，在大量的研究及調(diào)查后發(fā)現(xiàn):是法國(guó)人進(jìn)餐時(shí)喜歡飲用紅葡萄酒。進(jìn)而更加深入的研究發(fā)現(xiàn)，在紅葡萄酒中的重要成分白藜蘆醇(Resveratrol)發(fā)揮了降低冠心病發(fā)病率的主要作用。
　　體外實(shí)驗(yàn)已證實(shí)

3、，白藜蘆醇能降低神經(jīng)元細(xì)胞受到的損傷。研究發(fā)現(xiàn)白藜蘆醇能夠保護(hù)神經(jīng)元細(xì)胞，避免或減少缺氧、缺血和毒素造成的損害。白藜蘆醇可以明顯減輕體外培養(yǎng)的大鼠海馬腦組織細(xì)胞，因長(zhǎng)時(shí)間缺氧、缺血造成的損傷。小劑量的白藜蘆醇就能夠明顯減輕在體外研究中非常經(jīng)典的缺血缺氧細(xì)胞模型-氧糖剝奪損傷模型造成的神經(jīng)細(xì)胞的壞死;有研究結(jié)果提出:白藜蘆醇對(duì)新生大鼠腦片培養(yǎng)組織中的多巴胺神經(jīng)元，有一定的保護(hù)作用。這些體外的實(shí)驗(yàn)研究，能更好的幫助我們理解白黎蘆醇對(duì)各種神經(jīng)

4、損傷保護(hù)作用的機(jī)制。
　　大腦的認(rèn)知功能與中樞膽堿能系統(tǒng)關(guān)系緊密;而乙酰膽堿(acetylcholine，ACh)，又是膽堿能系統(tǒng)中和認(rèn)知功能關(guān)系最為密切的神經(jīng)遞質(zhì)，在中樞膽堿能系統(tǒng)中，乙酰膽堿分布十分廣泛。對(duì)阿爾茨海默氏病(AD)患者發(fā)生記憶缺失的病因進(jìn)行研究，發(fā)現(xiàn)其大腦中膽堿能神經(jīng)元的減少是一個(gè)非常重要的致病因素。神經(jīng)元細(xì)胞胞質(zhì)內(nèi)的膽堿乙酰轉(zhuǎn)移酶(Choline acetyltransferase，ChAT)會(huì)把膽堿和乙酰輔酶

5、A催化合成乙酰膽堿，并且釋放到細(xì)胞外形成囊泡。在去極化過(guò)程中，乙酰膽堿經(jīng)過(guò)胞外分泌到達(dá)突觸間隙，與其受體（包括毒蕈堿和煙堿受體）結(jié)合，發(fā)揮作用。大腦中各種原因造成的乙酰膽堿和其受體水平的降低，導(dǎo)致了中樞膽堿能系統(tǒng)功能減退、進(jìn)一步導(dǎo)致認(rèn)知功能損害。因此，針對(duì)膽堿能系統(tǒng)的治療一直是改善大腦認(rèn)知障礙的重要目標(biāo)之一。
　　在本實(shí)驗(yàn)中，我們擬通過(guò)動(dòng)物實(shí)驗(yàn)，制備動(dòng)物模型，并對(duì)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物實(shí)施Morris水迷宮實(shí)驗(yàn);觀察使用白藜蘆醇治療能否改善實(shí)驗(yàn)

6、大鼠受損的認(rèn)知能力，從而來(lái)證實(shí)白藜蘆醇是否具備神經(jīng)保護(hù)作用。并通過(guò)研究及實(shí)驗(yàn)，觀察在頸動(dòng)脈狹窄大鼠大腦海馬膽堿能系統(tǒng)中，三個(gè)關(guān)鍵酶:膽堿乙酰轉(zhuǎn)移酶(ChAT)、乙酰膽堿酯酶(AChE)和囊泡乙酰膽堿轉(zhuǎn)運(yùn)酶(Vacht)的表達(dá)，及大腦中這三種酶mRNA表達(dá)的水平有無(wú)變化，探討白藜蘆醇是否是通過(guò)膽堿能系統(tǒng)起到神經(jīng)保護(hù)功能，并明確其作用機(jī)制。
　　方法:
　　本實(shí)驗(yàn)選取30只雄性Sprague Dawley(SD)大鼠，將它們隨機(jī)

7、分為3組，每組各10只:分別為假手術(shù)組(Sham)、模型組(Model)和治療組(Tau)。對(duì)模型組大鼠進(jìn)行手術(shù)，建立頸動(dòng)脈狹窄動(dòng)物模型;對(duì)治療組大鼠同樣建立狹窄動(dòng)物模型，并采用白藜蘆醇治療;而假手術(shù)組大鼠只實(shí)施頸動(dòng)脈游離。
　　首先，建立大鼠頸動(dòng)脈狹窄實(shí)驗(yàn)?zāi)Ｐ?。使用水合氯醛?duì)大鼠實(shí)施腹腔注射麻醉，然后將其固定在手術(shù)臺(tái)上，采用頸正中切口，逐層切開(kāi)、分離，暴露雙側(cè)頸總動(dòng)脈。在模型組和治療組，游離大鼠雙側(cè)頸總動(dòng)脈后，用O號(hào)手術(shù)絲線結(jié)扎

8、。對(duì)于假手術(shù)組大鼠，僅游離雙側(cè)頸總動(dòng)脈，未予以結(jié)扎。手術(shù)后每只大鼠肌肉注射青霉素以避免感染。大鼠術(shù)后可自由進(jìn)食、進(jìn)水。
　　建模完成后，稱量每只治療組大鼠的重量，以100mg/Kg的劑量，予以每一只大鼠白藜蘆醇入胃給藥，4周時(shí)間內(nèi)一天一次。給予模型組和假手術(shù)組大鼠注射等量無(wú)菌生理鹽水作為對(duì)照。飼養(yǎng)大鼠4周，然后對(duì)各組大鼠進(jìn)行Morris水迷宮試驗(yàn)，評(píng)測(cè)實(shí)驗(yàn)大鼠的認(rèn)知能力。實(shí)驗(yàn)中使用電腦跟蹤系統(tǒng)記錄:①大鼠穿越平臺(tái)多少次;②大鼠在平

9、臺(tái)附近保持多少時(shí)間;③大鼠到達(dá)平臺(tái)的距離。
　　Morris水迷宮實(shí)驗(yàn)結(jié)束后，使用戊巴比妥鈉將大鼠麻醉，立即將大鼠斷頭、去腦，分離海馬。稱重后，將其放入玻璃勻裝管中，制備勻裝液，離心后取上清液放Eppendorf管內(nèi)，并放入-20℃冰箱冷藏備用。其余所有的腦組織標(biāo)本在-80℃條件下保存，以待進(jìn)行進(jìn)一步生化分析。測(cè)定AChE活性。原理:采用Ellman的方法測(cè)定乙酰膽堿酯酶的活力，通過(guò)測(cè)定乙酰膽堿的分解產(chǎn)物5-巰基-硝基苯甲酸在41

10、2nm吸光度的增加速率，檢測(cè)AChE的活性。測(cè)定ChAT活性:ACh在ChAT作用后，底物之一為乙酰輔酶A，它可結(jié)合顯色劑，于324納米處通過(guò)吸光度予以測(cè)定含量。采用qRT-PCR檢測(cè)大鼠海馬AChE，ChAT和Vacht的mRNA表達(dá)。
　　結(jié)果:
　　1.水迷宮試驗(yàn)中，假手術(shù)組大鼠的逃避潛伏期表現(xiàn)出持續(xù)縮短的模式，表明本組學(xué)習(xí)能力未受影響。在模型組，逃避潛伏期沒(méi)有持續(xù)縮短，而且遠(yuǎn)遠(yuǎn)高于假手術(shù)組。在治療組，經(jīng)過(guò)白藜蘆醇治療

11、，觀察到與假手術(shù)組相同的模式，即逃避潛伏期隨著訓(xùn)練進(jìn)行而持續(xù)下降。雖然與模型組相比，治療組的逃避潛伏期仍高于假手術(shù)組，但是其潛伏期大幅度降低，表明白藜蘆醇能夠部分恢復(fù)大鼠認(rèn)知學(xué)習(xí)能力。
　　2.白藜蘆醇增加了大鼠海馬的AChE，ChAT和Vacht的表達(dá)水平。本實(shí)驗(yàn)研究，測(cè)量了大鼠海馬的AChE，ChAT和Vacht的表達(dá)水平。在模型組大鼠中，所有這些酶表達(dá)水平明顯降低，表明頸動(dòng)脈狹窄導(dǎo)致的腦損傷降低了這些酶的產(chǎn)生。使用白藜蘆醇治

12、療后治療組大鼠，所有這三種酶的表達(dá)水平盡管不如假手術(shù)組高，但是均比模型組有所增加。測(cè)量中樞膽堿能系統(tǒng)中關(guān)鍵酶AChE和ChAT的活性:假手術(shù)組大鼠AChE活性為0.68±0.04U·m g-1pro，而模型組AChE活性降低至0.36±0.05U·m g-1pro。白藜蘆醇治療后，治療組大鼠AChE活性增加到0.49±0.02U·m g-1pro。ChAT活性觀察結(jié)果相似，假手術(shù)組的活性為165.53±1.95U·m g-1pro，明顯

13、高于模型組105.74±2.64U·m g-1pro。白藜蘆醇治療能夠?qū)hAT活性提高到136.82±2.45U·mg-1pro。
　　3.通過(guò)RT-PCR對(duì)AChE，ChAT和Vacht的mRNA表達(dá)水平進(jìn)行檢測(cè):與假手術(shù)組相比，模型組大鼠所有三個(gè)酶的mRNA水平均顯著降低。治療組經(jīng)過(guò)白藜蘆醇治療，這三個(gè)酶的mRNA得以增加，高于模型組。
　　結(jié)論:
　　1.白藜蘆醇縮短了頸動(dòng)脈狹窄閉塞認(rèn)知受損大鼠的逃避潛伏期

14、r>　　治療組大鼠的逃避潛伏期隨著訓(xùn)練進(jìn)行而持續(xù)下降。治療組大鼠的逃避潛伏期雖然仍高于假手術(shù)組，但與模型組相比，其潛伏期大幅度降低，表明白藜蘆醇能夠恢復(fù)部分學(xué)習(xí)認(rèn)知能力。
　　2.白藜蘆醇提高了認(rèn)知障礙大鼠的認(rèn)知記憶功能
　　模型組大鼠在三項(xiàng)措施中表現(xiàn)出一致的結(jié)果，表明頸動(dòng)脈狹窄條件下的認(rèn)知障礙和學(xué)習(xí)能力下降，他們降低了跨越平臺(tái)的次數(shù)和保持在平臺(tái)附近的時(shí)間，并增加了到達(dá)平臺(tái)的逃離距離。而在用白藜蘆醇治療的治療組中，大鼠表現(xiàn)出

15、了一定的認(rèn)知學(xué)習(xí)能力的改善，其測(cè)定結(jié)果位于假手術(shù)組和模型組之間。
　　3.白藜蘆醇改善AChE和ChAT的活性
　　本實(shí)驗(yàn)中，檢測(cè)了中樞膽堿能系統(tǒng)中AChE和ChAT關(guān)鍵酶活性:假手術(shù)組大鼠AChE活性為0.68±0.04U·m g-1pro，而模型組AChE活性降低至0.36±0.05U·m g-1pro。白藜蘆醇治療后，治療組大鼠AChE活性增加0.49±0.02U·m g-1pro。ChAT活性觀察結(jié)果相似，假手術(shù)組的

16、活性為165.53±1.95U·m g-1pro，明顯高于模型組105.74±2.64U·m g-1pro。白藜蘆醇治療能夠?qū)hAT活性提高到136.82±2.45U·m g-1pro。
　　4.白藜蘆醇增加了大鼠海馬的AChE，ChAT和Vacht的表達(dá)水平
　　測(cè)量大鼠海馬的AChE，ChAT和Vacht的表達(dá)水平。在模型組大鼠中，所有這些酶的表達(dá)水平明顯降低，表明頸動(dòng)脈狹窄導(dǎo)致腦損傷降低了這些酶的產(chǎn)生。在治療組大鼠大

17、腦海馬中，所有這二種酶的表達(dá)水平盡管不如假手術(shù)組高，但是均比模型組有所增加。這些結(jié)果表明，白藜蘆醇能夠影響這些酶的表達(dá)，而白藜蘆醇也是通過(guò)他們能夠在認(rèn)知功能保護(hù)方面發(fā)揮作用。
　　5.白藜蘆醇上調(diào)大鼠海馬AChE，ChAT和Vacht的mRNA表達(dá)
　　我們也通過(guò)RT-PCR研究了AChE，ChAT和Vacht的mRNA表達(dá)水平，與假手術(shù)組相比，模型組大鼠所有三個(gè)基因mRNA水平均顯著降低。治療組經(jīng)過(guò)白藜蘆醇治療，這三個(gè)基因