橡膠樹膠孢炭疽菌CgATG4和CgATG8基因的克隆與功能初步分析.pdf

1、天然橡膠（Hevea brasiliensis）是一種重要的工業(yè)原料和不可缺少的戰(zhàn)略物資。橡膠種植業(yè)是我國(guó)熱帶地區(qū)重要的支柱產(chǎn)業(yè)和優(yōu)勢(shì)產(chǎn)業(yè)。由膠孢炭疽菌（Colletotrichum gloeosporioides）引起的橡膠樹炭疽病是當(dāng)前橡膠生產(chǎn)上最為嚴(yán)重的葉部病害之一，影響干膠產(chǎn)量損失達(dá)7-45％。至今，國(guó)內(nèi)外對(duì)該病菌分子致病機(jī)理的研究報(bào)道極少，克隆和鑒定該病菌致病相關(guān)基因，選育抗性品種和創(chuàng)新防治策略，是產(chǎn)業(yè)發(fā)展中亟待解決的植保問題

2、。
　　 本研究是在前期已建立的橡膠樹膠孢炭疽菌HBCg01菌株T-DNA插入突變體庫(kù)的基礎(chǔ)上，建立HBCg01菌株突變體篩選方法，篩選獲得致病性缺陷突變株CG1988，通過Tail-PCR技術(shù)分離獲得CG1988突變株T-DNA插入位點(diǎn)側(cè)翼序列。同時(shí)，結(jié)合HBCg01菌株的全基因數(shù)據(jù)庫(kù)，通過本地Blast程序分離克隆了T-DNA標(biāo)記基因CgATG4基因，并利用同源克隆法克隆了同時(shí)參與細(xì)胞自噬過程，與CgATG4功能密切相關(guān)的C

3、gATG8基因;獲得CgATG4和CgATG8基因敲除突變株，并對(duì)敲除突變株進(jìn)行表型分析。獲得以下主要研究結(jié)果:
　　 以中度感病品種——熱研7-33-97為致病缺陷型突變體篩選寄主，建立HBCg01菌株突變體篩選方法:以無傷口、古銅色葉期的熱研7-33-97葉片為接種材料，初篩接種帶菌瓊脂塊，獲得的致病缺陷菌再用孢子懸浮液接種重復(fù)驗(yàn)證。從4128個(gè)膠孢炭疽菌T-DNA插入突變轉(zhuǎn)化子中篩選得到165個(gè)致病缺陷突變菌，再接種孢子懸

4、浮液做三次重復(fù)致病性測(cè)定，篩選到32個(gè)致病缺陷突變菌。
　　 利用Tail-PCR技術(shù)分離獲得CG1988突變株T-DNA插入位點(diǎn)側(cè)翼序列。生物信息學(xué)分析表明:CG1988突變株T-DNA插入基因與細(xì)胞自噬相關(guān)基因CgATG4高度同源;CgATG4基因ORF大小為1129bp，CDS大小為960 bp，包含3個(gè)外顯子和2個(gè)內(nèi)含子，含有一個(gè)完整的開放閱讀框(ORF)，編碼319個(gè)氨基酸殘基，分子量約為35.01kD，含有一個(gè)高度保

5、守的peptidase_C54半胱氨酸蛋白酶結(jié)構(gòu)域。
　　 利用同源克隆法克隆了同參與細(xì)胞自噬過程，與CgATG4功能密切相關(guān)的CgATG8基因。生物信息學(xué)和分子分析發(fā)現(xiàn)，CgATG8基因在基因組中為單拷貝，其ORF為600bp，CDS為366bp，包含3個(gè)外顯子和2個(gè)內(nèi)含子，含有一個(gè)完整的開放閱讀框(ORF)，編碼121個(gè)氨基酸殘基，分子量約為14.04 kD，含有高度保守的GABARAP蛋白酶結(jié)構(gòu)域。
　　 構(gòu)建Cg