巴西橡膠樹膠乳非細(xì)胞凋亡體系的研究及應(yīng)用.pdf

1、本研究以橡膠樹膠乳和煙草為研究材料,進(jìn)行巴西橡膠樹膠乳非細(xì)胞凋亡體系的研究。
　　 鑒定轉(zhuǎn)HbMyb1基因煙草。通過形態(tài)學(xué)鑒定、PCR檢測(cè)及Southern檢測(cè),證明實(shí)驗(yàn)所用的煙草為轉(zhuǎn)HbMyb1基因煙草。
　　 建立煙草細(xì)胞懸浮培養(yǎng)體系,實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明:以MS+2,4-D0.5mg/L+KT0.5mg/L+瓊脂7.5g/L誘導(dǎo)煙草愈傷效果最好;最佳繼代培養(yǎng)基為MS+2,4-D0.3mg/L+KT0.3mg/L+瓊脂7.5

2、g/L,繼代四代之后可獲得脆散性愈傷組織;將所得脆散性愈傷組織接種于MS+2,4-D0.2mg/L+KT0.2mg/L+0.1％水解酪蛋白液體培養(yǎng)基中,可獲得生長(zhǎng)迅速、顏色淡黃、分散性和均一性均較好的煙草細(xì)胞懸浮系;第7天為煙草懸浮培養(yǎng)細(xì)胞的最佳繼代時(shí)間。
　　 采用不同方法采集膠乳,提取膠乳DNA,結(jié)果顯示不同采集方法對(duì)膠乳DNA的完整性沒有明顯影響。膠乳經(jīng)超速離心后分為三層(上層主要是橡膠粒子,中間層是膠乳的可溶性胞質(zhì)成分,

3、下層主要是黃色體),分別對(duì)這三層提取DNA,發(fā)現(xiàn)DNA幾乎全部集中于黃色體層中。證明膠乳的可溶性胞質(zhì)中幾乎不含有DNA,不會(huì)干擾到后續(xù)的實(shí)驗(yàn)。
　　 在膠乳非細(xì)胞體系加入細(xì)胞色素c,至終濃度為2.5μmol/L,可將該非細(xì)胞體系轉(zhuǎn)化為凋亡誘導(dǎo)體系。在該體系中加入煙草細(xì)胞核,23℃溫浴,可誘導(dǎo)煙草細(xì)胞核發(fā)生細(xì)胞凋亡,TUNEL檢測(cè)呈陽(yáng)性,瓊脂糖凝膠電泳產(chǎn)生典型的DNA Ladder。在誘導(dǎo)煙草細(xì)胞核發(fā)生細(xì)胞凋亡的過程中,發(fā)現(xiàn)轉(zhuǎn)Hb