鐵皮石斛與炭疽菌互作機(jī)制的初步探討.pdf

1、目的:
　　鐵皮石斛(Dendrobium officinal Kimura et Migo)為蘭科石斛屬多年生草本，具有益胃生津，滋陰清熱的功效。鐵皮石斛以新鮮或干燥的莖入藥，為藥食兩用的名貴中藥材，野生資源分布在廣東、福建、安徽、浙江、廣西、云南等地區(qū)的陰濕、溫暖的環(huán)境中。野生鐵皮石斛越來越少，隨需求量的不斷增大，鐵皮石斛人工栽培面積不斷擴(kuò)大，高度集約化的種植，加之通風(fēng)不暢，生長(zhǎng)環(huán)境普遍高溫、高濕，成為多種有害病菌的溫床。近年

2、來，人工種植鐵皮石斛病害有逐年加重的趨勢(shì)，且不易治理，損失較大。目前除了大量噴灑化學(xué)藥物，尚無高效的防治辦法，病害防治成為鐵皮石斛種植產(chǎn)業(yè)中關(guān)鍵的一環(huán)，若要高效快速防治病害的發(fā)生必須先了解其病原物，才能提出相應(yīng)的高效易行的防治措施。因此，本研究綜合形態(tài)特征、培養(yǎng)性狀、Illumina HiSeq高通量測(cè)序及生物信息學(xué)分析確定鐵皮石斛病原物種，并系統(tǒng)研究其物種的生物學(xué)特性，為病害防治提供依據(jù);同時(shí)深入研究鐵皮石斛感染炭疽病后的代謝組學(xué)與蛋

3、白組學(xué)，探討與病害相關(guān)的代謝物、蛋白質(zhì)及其可能的作用機(jī)理，為鐵皮石斛抗病品種創(chuàng)制或選育提供理論支持。
　　方法:
　　本研究通過建立鐵皮石斛病原菌分離鑒定體系，并系統(tǒng)研究鐵皮石斛炭疽病病原的生物學(xué)特性，感染炭疽病后的代謝組學(xué)與蛋白質(zhì)組學(xué)，探討有關(guān)病程的代謝物、蛋白質(zhì)及其分子機(jī)制。具體工作包括:
　　1.鐵皮石斛病原菌分離鑒定體系的建立:從鐵皮石斛炭疽病葉中分離純化的菌株，經(jīng)致病性測(cè)定表明為鐵皮石斛病原菌，采用觀察病害癥

4、狀、培養(yǎng)性狀、形態(tài)學(xué)特征、Illumina HiSeq高通量測(cè)序及生物信息學(xué)分析手段確定病原菌物種;
　　2.根據(jù)鐵皮石斛病樣分離純化鑒定的結(jié)果，選炭疽菌的代表性菌株，研究不同因素對(duì)其生物學(xué)特性的影響;
　　3.采集經(jīng)膠孢炭疽菌處理的感病鐵皮石斛葉片，經(jīng)樣本前處理、GC/MS分析、生物信息學(xué)分析等找出差異代謝物，初步探討參與病害的差異代謝物及代謝通路分析;
　　4.采集經(jīng)膠孢炭疽菌處理后鐵皮石斛感病葉片，經(jīng)樣品制備、蛋

5、白定量、SDS-PAGE電泳樣品的檢測(cè)、蛋白還原烷基化及酶解、反相色譜分離、蛋白鑒定、生物信息學(xué)分析等找出差異蛋白質(zhì)，初步探討參與病害過程的蛋白質(zhì)及其作用機(jī)理。
　　結(jié)果:
　　1.鐵皮石斛病原菌分離鑒定體系的建立:綜合鐵皮石斛病原真菌的培養(yǎng)性狀、形態(tài)學(xué)特征、致病性測(cè)定、Illumina HiSeq高通量測(cè)序分析及全基因組進(jìn)化樹將各代表菌株分別鑒定為白紋羽病菌或褐座堅(jiān)殼菌（Rosellinia necatrix）、R.nec

6、atrix、膠孢炭疽菌(Colletotrichum gloeosporioides)、Diaporthe ampelina、Podospora anserina、圍小叢殼菌（Glomerella cingulata）、菜豆殼球孢（Macrophomina phaseolina）、D.ampelina。DFW07-B菌株未能確定物種，但是否為新物種尚不能確定，有待進(jìn)一步的研究。其中，白紋羽病菌或褐座堅(jiān)殼菌（R.necatrix）、D.a

7、mpelina、P.anserina、圍小叢殼菌(G.cingulata)、菜豆殼球孢(M.phaseolina)為鐵皮石斛病原真菌的新紀(jì)錄種。
　　2.鐵皮石斛病原菌生物學(xué)特性分析:鐵皮石斛膠孢炭疽菌在PDA、PSA培養(yǎng)基上較適宜菌絲生長(zhǎng)并促進(jìn)分生孢子的產(chǎn)生;菌絲在10～35℃下均可生長(zhǎng)，20～30℃下菌絲濃密且生長(zhǎng)速度快，20℃時(shí)最利于產(chǎn)生分生孢子;pH5～12條件下菌絲均可以生長(zhǎng)，最適宜產(chǎn)生分生孢子的pH為7;菌絲在光照條件

8、下生長(zhǎng)速度快，黑暗下益于產(chǎn)生孢子;以葡萄糖、蔗糖、麥芽糖為碳源的培養(yǎng)基宜于菌絲生長(zhǎng)，可溶性淀粉最益于產(chǎn)生分生孢子;蛋白胨是最利于菌絲濃密生長(zhǎng)及產(chǎn)生分生孢子的氮源;菌絲與分生孢子的致死溫度均為55℃。
　　鐵皮石斛圍小叢殼菌在PDA上較適宜生長(zhǎng);28℃時(shí)菌絲最濃密、生長(zhǎng)最快，子囊殼產(chǎn)量也最高;光照可促進(jìn)子囊殼的產(chǎn)生;pH8時(shí)菌絲生長(zhǎng)最快，pH9時(shí)子囊殼產(chǎn)量最高;山梨醇對(duì)菌絲的生長(zhǎng)最有利，在麥芽糖碳源上菌絲濃密，子囊殼的產(chǎn)量達(dá)到最高;

9、菌絲對(duì)蛋白胨氮源的利用率最高。菌絲體的水浴致死條件是50℃。
　　3.鐵皮石斛與膠孢炭疽病互作代謝組學(xué)分析:成功建立了各分析組的多維統(tǒng)計(jì)分析模型，并結(jié)合單維統(tǒng)計(jì)分析，從鑒定出的305個(gè)代謝物共篩選出84個(gè)差異代謝產(chǎn)物。感病材料含有除亞氨基二乙酸(iminodiacetic acid)外的83種差異代謝物，且其中的36種為感病組特有的代謝物，其余的47種代謝物中絕大多數(shù)在感病材料中的含量呈不同程度的上升趨勢(shì)，而下調(diào)的僅有4種。可能與

10、病程相關(guān)的代謝物有海因、亞精胺、熊果苷、海藻糖-6-磷酸、馬尿酸、兒茶酚、草酸等，其中酒石酸、丙二酸、兒茶酚有加重鐵皮石斛病情的趨勢(shì)，有待進(jìn)一步分析研究。
　　4.鐵皮石斛與膠孢炭疽病互作的蛋白質(zhì)組學(xué)分析:成功建立了iTRAQ技術(shù)分析鐵皮石斛感病組-正常組蛋白組學(xué)體系，共鑒定3956個(gè)蛋白，可信蛋白數(shù)為2246個(gè)，篩選出133個(gè)感病組-正常組差異表達(dá)蛋白，其中表達(dá)上調(diào)蛋白67個(gè)，而表達(dá)下調(diào)蛋白有66個(gè)。GO功能分類及其富集表明這些

11、差異蛋白主要參與轉(zhuǎn)運(yùn)活性、催化活性和酶調(diào)控活性，KEGG通路顯著性富集于代謝途徑、次生代謝產(chǎn)物生物合成、碳代謝、內(nèi)質(zhì)網(wǎng)蛋白質(zhì)加工、乙醛酸鹽代謝、光合作用、光合生物中的碳固定等。并找出與病程相關(guān)的熱休克蛋白70、蔗糖合酶、抗真菌蛋白、葉綠素a/b結(jié)合蛋白等，為蛋白水平研究鐵皮石斛病害及培育抗病品種提供依據(jù)。
　　結(jié)論:
　　以感病的鐵皮石斛葉片為試驗(yàn)材料，基于Illumina HiSeq高通量測(cè)序技術(shù)建立了鐵皮石斛病原菌分離鑒