GFP基因標記的杧果膠孢炭疽菌的特性研究.pdf

1、由膠孢炭疽菌（Colletotrichum gloeosporioides）引起的杧果炭疽病是杧果生產(chǎn)中危害性最大的菌物病害之一，對杧果生產(chǎn)造成嚴重的經(jīng)濟損失和食品安全問題。本研究以綠色熒光蛋白基因(green fluorescent protein，GFP)為標記基因，利用聚乙二醇（PEG）介導(dǎo)轉(zhuǎn)化法，構(gòu)建杧果炭疽菌遺傳轉(zhuǎn)化體系，探索標記菌株與野生菌株之間的生物學(xué)特性與致病性差異，為了解膠孢炭疽菌的潛伏致病機理、建立監(jiān)測其侵染狀況和制

2、定有效的防治措施提供科學(xué)依據(jù)。研究結(jié)果如下：
　　1.采自海南省文昌果園臺農(nóng)杧果的發(fā)病果實，經(jīng)分離、純化、形態(tài)鑒定、致病性測定和分子鑒定，獲得一株C.gloeosporioides的野生菌株（MCGW）。
　　2.借助GFP標記和PEG介導(dǎo)轉(zhuǎn)化技術(shù)，構(gòu)建杧果炭疽菌遺傳轉(zhuǎn)化體系。其關(guān)鍵條件為：實驗受體為36h的新鮮菌絲；用0.1mol/LpH5.5~6.0的磷酸緩沖液（含0.8MNaCl）配制10mg/mL的溶壁酶液；30℃，

3、80rpm酶液酶解2.5~3h。
　　3.經(jīng)過HmB抗性鑒定、熒光顯微鏡觀察、PCR鑒定和遺傳穩(wěn)定性測定，驗證了GFP基因已成功轉(zhuǎn)入C.gloeosporioides，并能在轉(zhuǎn)化子內(nèi)穩(wěn)定遺傳。獲得了GFP標記的杧果膠孢炭疽菌菌株（MCGT）。
　　4.系統(tǒng)比較MCGT菌株與MCGW菌株的生物學(xué)、生理學(xué)方面的特性。發(fā)現(xiàn)MCGT與MCGW在形態(tài)特征、有氧呼吸量、細胞滲透性等無顯著的差異。表明轉(zhuǎn)入GFP基因?qū).gloeospor

4、ioides的生物學(xué)、生理學(xué)方面無顯著影響。用MCGT與MCGW分別對杧果的花器、幼果接種測定其致病性。杧果的花器、幼果用兩菌株接種后的發(fā)病率均在78%以上。表明MCGT與MCGW對杧果的致病性無顯著差異。
　　5.利用激光共聚焦顯微鏡觀察MCGT在杧果果實組織內(nèi)的定殖與擴展情況。發(fā)現(xiàn)MCGT菌絲在果皮與果肉組織中均有分布；少量的菌絲在果皮細胞間隙分布，果皮組織基本保持完好狀態(tài)；有大量菌絲充斥在果肉組織內(nèi)，果肉組織崩潰。認為，該現(xiàn)