膠孢炭疽菌ES026石杉堿甲合成途徑關(guān)鍵酶基因CgCAO、CgLDC的克隆和功能驗證.pdf_第1頁
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文檔簡介

1、石杉堿甲(Huperzine A)作為新一代治療阿爾茨海默病的藥物具有較好的前景,最先是從石松科植物中發(fā)現(xiàn)并提取,但由于人工合成石杉堿甲技術(shù)不成熟,植物資源匱乏,所以其產(chǎn)量受到了極大的限制。近些年來,很多學者分離報道很多產(chǎn)石杉堿甲的內(nèi)生真菌,由于這一報道結(jié)果,因此分離產(chǎn)石杉堿甲的內(nèi)生菌已成為新的熱點。本實驗材料是根據(jù)在前期研究試驗中從蛇足石杉植物中分離得到了一株產(chǎn)石杉堿甲的內(nèi)生真菌膠孢炭疽菌ES026,并已經(jīng)申請專利。在本研究中,根據(jù)前

2、期對膠孢炭疽菌ES026的基因組數(shù)據(jù)和轉(zhuǎn)錄組測序數(shù)據(jù)分析及基因功能注釋結(jié)果,得出賴氨酸脫羧酶和銅胺氧化酶被注釋到石杉堿甲生物合成路徑中,為了驗證賴氨酸脫羧酶和銅胺氧化酶的功能,本研究主要做了一下幾個方面的內(nèi)容:
  1.成功在膠孢炭疽菌ES026中克隆了賴氨酸脫羧酶基因(CgLDC)和銅胺氧化酶基因(CgCAO),CgLDC序列全長769 bp,CgCAO序列全長2072 bp。
  2.CgLDC和CgCAO的體外異源表達

3、與蛋白純化構(gòu)建異源表達載體:pET28a-CgLDC和pET28a-CgCAO,轉(zhuǎn)化至大腸桿菌表達菌株BL21(DE3)中。優(yōu)化了蛋白表達條件,并利用優(yōu)化后的蛋白純化方法得到純化后的CgLDC蛋白和CgCAO蛋白進行體外酶促活性反應,反應產(chǎn)物通過LC-MS分析,發(fā)現(xiàn)CgLDC具有催化L-Lysine生成尸胺的能力,CgCAO具有催化尸胺生成△1-Piperideine的能力。
  3.膠孢炭疽菌ES026中CgLDC基因和CgCA

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