柑橘膠孢炭疽菌毒素的粗提取及致病性研究.pdf

1、炭疽病是嚴(yán)重影響柑橘采后貯藏的重要病害，半知菌亞門(mén)炭疽菌屬的膠孢炭疽菌(Colletotrichum gloeosporioides)為柑橘炭疽病的主要致病菌，有較強(qiáng)的致病能力，能引起貯藏期間的柑橘產(chǎn)生病斑甚至腐爛，造成嚴(yán)重的經(jīng)濟(jì)損失。目前國(guó)內(nèi)對(duì)柑橘炭疽病的研究主要集中于病原菌的生長(zhǎng)特性及其拮抗菌篩選等方面，對(duì)于膠孢炭疽菌毒素致病性的報(bào)道較少。國(guó)外有關(guān)膠孢炭疽菌毒力大小的研究指出環(huán)境pH、病原菌的分泌蛋白和編碼與致病力有關(guān)的基因是病原菌

2、的毒力因子，改變pH等條件會(huì)影響病原菌的致病力。然而，這些報(bào)道主要集中在毒素的產(chǎn)生條件、結(jié)構(gòu)分析和是否具有寄主專(zhuān)化性等。本試驗(yàn)研究了膠孢炭疽菌的最佳產(chǎn)毒培養(yǎng)基以探究最適產(chǎn)毒因子；毒素的粗提取以及粗毒素對(duì)柑橘顯微結(jié)構(gòu)以及生理代謝的影響以探究毒素的致病性；對(duì)羥基苯甲酸對(duì)采后柑橘的抗性誘導(dǎo)以探究柑橘貯藏的新方式等。主要研究結(jié)果如下：
　　1、體外培養(yǎng)膠孢炭疽菌，通過(guò)改變培養(yǎng)基的類(lèi)型和成分來(lái)研究最佳產(chǎn)毒培養(yǎng)基。研究表明：不同類(lèi)型的培養(yǎng)基中

3、察氏培養(yǎng)基產(chǎn)生的毒素能在柑橘上形成較大病斑；改變察氏培養(yǎng)基中碳源、氮源和無(wú)機(jī)鹽的種類(lèi)可以影響毒素的生成，最佳的碳源為果糖，氮源為硝酸鈉，無(wú)機(jī)鹽為磷酸氫二鉀；通過(guò)四因素四水平正交實(shí)驗(yàn)研究產(chǎn)毒的最適培養(yǎng)條件，分別為溫度30℃，時(shí)間19天，轉(zhuǎn)速100 r/min，pH為8。在此條件下產(chǎn)生的病斑直徑為5.39±0.22 mm。
　　2、在最適產(chǎn)毒培養(yǎng)基的基礎(chǔ)上，通過(guò)比較硫酸銨分級(jí)沉淀法和不同極性有機(jī)溶劑浸提法來(lái)研究膠孢炭疽菌毒素的粗提取，

4、得出甲醇浸提后得到的上清液能產(chǎn)生最大的病斑。經(jīng)基本化學(xué)本質(zhì)分析得出粗毒素含有的主要成分為酮糖、蛋白或氨基酸等極性物質(zhì)。高溫和改變pH值均會(huì)影響粗毒素的活性。
　　3、將得到的粗毒素配制成不同的濃度以研究粗毒素對(duì)柑橘果皮顯微結(jié)構(gòu)的影響，得出隨著粗毒素濃度的增加以及培養(yǎng)時(shí)間的延長(zhǎng)，粗毒素對(duì)柑橘果實(shí)細(xì)胞造成的傷害也越大，果皮細(xì)胞呈現(xiàn)出皺縮和破裂的形態(tài)。其原因可能是粗毒素中含有能夠水解細(xì)胞壁的相關(guān)酶類(lèi)以及某些致病成分。
　　4、研究

5、粗毒素對(duì)柑橘生理代謝的影響可知：膠孢炭疽菌粗毒素能使柑橘果實(shí)產(chǎn)生典型的病斑癥狀，且使丙二醛含量顯著增高，細(xì)胞壁成分含量降低。當(dāng)毒素濃度較低時(shí)，果實(shí)病斑直徑與多酚氧化酶活性、過(guò)氧化物酶活性、類(lèi)黃酮以及木質(zhì)素含量呈正相關(guān)；與纖維素、半纖維素和果膠含量呈負(fù)相關(guān)。毒素濃度增高時(shí)，果實(shí)機(jī)體及防御酶系統(tǒng)遭到破壞，酶活急劇下降。膠孢炭疽菌粗毒素能影響柑橘果實(shí)生理代謝，引起果實(shí)發(fā)病，最終導(dǎo)致病斑的形成。由此證明毒素在膠孢炭疽菌對(duì)柑橘的致病過(guò)程中起到重要

6、作用。
　　5、對(duì)羥基苯甲酸能夠誘導(dǎo)采后柑橘果實(shí)的抗性，延長(zhǎng)柑橘保質(zhì)期。試驗(yàn)中可知對(duì)羥基苯甲酸對(duì)采后柑橘炭疽病病原菌有較強(qiáng)的抑菌活性，濃度越高，對(duì)病原菌的抑制作用越強(qiáng)。經(jīng)對(duì)羥基苯甲酸處理的柑橘果實(shí)中，抗性相關(guān)酶活性升高，丙二醛含量下降。并且對(duì)羥基苯甲酸誘導(dǎo)的抗性相關(guān)酶在整個(gè)試驗(yàn)過(guò)程中維持較高的活性。對(duì)羥基苯甲酸處理對(duì)采后柑橘炭疽病病原菌有較強(qiáng)的抗菌作用，能提高柑橘果實(shí)相關(guān)抗性酶活性以及抑制膜脂過(guò)氧化反應(yīng)，誘導(dǎo)其果實(shí)抗性。對(duì)柑橘采后