平頭炭疽菌對大豆抗感品種的致病差異及其MAPK基因CtPMK1的功能研究.pdf

1、大豆(Glycinemax)是重要的經濟作物，在農業(yè)生產中占有重要地位。由平頭炭疽菌[Colletotrichumtruncatum(Schwein.)Andrus&W.D.Moore]侵染引起的大豆炭疽病是世界上大豆產區(qū)的重要病害之一，可造成大豆嚴重減產。因此，炭疽病的防治是大豆生產上的一個重要課題。本研究對田間采集分離到的大豆炭疽病病原菌進行分離鑒定，并從大豆品種的抗性篩選、大豆與炭疽菌的互作、炭疽菌的生長發(fā)育及致病分子調控機制等方

2、面進行研究，為認識和掌握該病害發(fā)生以及制定有效的防治策略提供生產上和理論上的依據。
　　1、從江蘇泰興和江浦兩個農場的大豆田中采集疑似炭疽病標本，經分離、純化及致病性測定得到41株致病菌。發(fā)現這些病原菌主要存在兩種菌落生長形態(tài)，其中一種與已報道的平頭炭疽菌相似，菌落為規(guī)則的圓形，邊緣整齊，菌絲疏松，幼嫩菌絲為白色，老齡菌絲為灰色;另一種未見有報道，菌落為不規(guī)則的圓形，邊緣不整齊，氣生菌絲少，中部菌絲為白色絨毛狀，外圍菌絲呈鮮艷的紅

3、褐色。從這兩種形態(tài)的致病菌中分別選取一株致病性強的代表性菌株進行ITS(internaltranscribedspacer)測序，測序結果發(fā)現與平頭炭疽菌C.truncatum同源性均達到100％。綜合形態(tài)學和分子生物學方法，將這兩類炭疽菌均鑒定為平頭炭疽菌，用于后續(xù)研究。
　　2、選育和利用抗病品種是防治大豆炭疽病的一種經濟有效的方法。明確大豆種質對大豆炭疽病的抗性，是大豆抗病育種的前提條件。本研究采用孢子懸浮液接種離體葉片的方

4、法，選用前面鑒定的兩類平頭炭疽菌代表性菌株JS11-32和TB8-15，對59份浙江大豆品種進行抗大豆炭疽病鑒定篩選研究，發(fā)現:對菌株JS11-32表現抗性的大豆品種占96.61％，對TB8-15表現抗性的品種占55.93％，而且對TB8-15表現抗性的品種對JS11-32均表現抗性?？梢娬憬蠖狗N質資源對平頭炭疽菌抗性較好，可以嘗試將部分抗性品種推廣。
　　3、通過臺盼藍染色對表現抗性（即非親和互作）的大豆品種5D068與作為對

5、照的感病品種（即親和互作）合豐47進行侵染差異觀察。發(fā)現:在接種炭疽菌后24h內，兩個品種中均出現分生孢子萌發(fā)和附著胞的形成;接種48h后，病原菌在感病品種葉片內形成侵染菌絲，而抗病品種葉片則顯示類似HR(HypersensitiveReaction)的細胞壞死反應。經DAB染色我們發(fā)現在侵染早期，抗病葉片在附著胞下面以及受侵染細胞內產生大量的活性氧(ROS)，甚至周圍未侵染細胞邊界也有ROS;而感病葉片只在附著胞的周圍有少量ROS的產

6、生。
　　4、MAPK信號通路在真核生物中相當保守，在病原真菌感受外界刺激、生長發(fā)育與形態(tài)建成、孢子產生與萌發(fā)等過程中具有非常重要的作用。本研究中，參照已公布全基因組序列的膠孢炭疽C.gloeosporioides和希金斯炭疽Chigginsianum中與Fus3-Kss1類MAPK基因同源的基因序列，設計引物在平頭炭疽菌Ctruncatum中克隆到一個同源基因，命名為CtPMK1。該基因編碼一個含355個氨基酸的多肽，含有MAP

7、K共有的11個蛋白激酶區(qū)域和1個MAPK激酶作用的磷酸化位點(TEY)。該基因敲除導致突變體菌絲生長速率下降、黑色素生成減少以及產孢量顯著下降;突變體喪失對大豆葉片的侵染能力，進一步試驗觀察到突變體分生孢子在洋蔥表皮細胞上無法形成附著胞，突變體菌絲頂端也無法形成附著胞類似結構。上述結果表明，CtPMK1參與調控炭疽病菌的侵入，從而影響炭疽菌對大豆的致病性。將Magnaportheoryzae中的PMK1基因互補CtPMK1缺失突變體，表