單核細胞增生性李斯特菌hfq基因缺失株的構(gòu)建及其生物學(xué)特性研究.pdf

1、單核細胞增生性李斯特菌hfq基因缺失株的構(gòu)建及其生物學(xué)特性研究研究生：康美琴導(dǎo)師：殷月蘭副教授焦新安教授中文摘要單核細胞增生性李斯特菌(Listeriamonocytogenes，Lm)是革蘭陽性的短桿菌，營腐生和寄生生活，是重要的食源性人獸共患病原菌。該菌在環(huán)境中廣泛分布，對低溫、酸堿和高滲透壓等環(huán)境抵抗力極強，是宿主譜較廣的兼性胞內(nèi)寄生菌。Lm在各種環(huán)境中適應(yīng)、生存并表現(xiàn)致病力，與調(diào)控因子的網(wǎng)絡(luò)調(diào)控密切相關(guān)。Hfq蛋白是Lm中新發(fā)現(xiàn)

2、的調(diào)控因子，在該菌生長代謝及毒力調(diào)控中的作用知之甚少。不同血清型Lm的生態(tài)分布和致病性存在較大差異，本文分別以血清型為1／2a的標(biāo)準(zhǔn)株EGDe和4b的高毒力菌株NTSN為研究對象，利用同源重組技術(shù)構(gòu)建了hfq基因缺失的突變株及回復(fù)株，比較其與野生株對環(huán)境脅迫及小鼠致病特性，探索調(diào)控因子Hfq在Lm致病及抵抗外界壓力方面的作用。1單核細胞增生性李斯特菌hfq缺失株及回復(fù)株的構(gòu)建與鑒定利用同源重組技術(shù)分別成功構(gòu)建了單核細胞增生性李斯特菌EG

3、De菌株及NTSN菌株辦向基因的缺失株。在擴增出待敲除基因兩翼的同源片段之后，利用SOEingPCR方法將其拼接在一起，插入穿梭載體pKSV7中，經(jīng)電轉(zhuǎn)化導(dǎo)入EGDe和NTSN感受態(tài)細胞中。通過溫度和氯霉素抗性壓力，實現(xiàn)兩次同源重組，對重組克隆用PCR方法和RTPCR方法進行鑒定，將陽性克隆命名為EGDeAhfq、NTSNAhfq。另外，將hfq基因及其啟動子序列構(gòu)建進pERL3質(zhì)粒中，通過電轉(zhuǎn)化的方法導(dǎo)入感受態(tài)細胞NTSNAhfq中，

4、獲得物基因回復(fù)株，命名為NTSNAhfq一桷。對親本株、物缺失株及回復(fù)株的生長曲線、生理生化特性、溶血活性進行了測定。實驗結(jié)果表明，EGDeAhfq、NTSNAhfq的生長趨勢與野生株相似，溶血活性未發(fā)生明顯變化，但EGDeAhfq喪失0【葡萄糖苷酶活性，NTSNAhfq喪失亮氨酸芳胺酶(LeuA)活性及乳糖氧化能力(LAC)，表明桷基因的缺失對細菌正常的生長未造成明顯影響，但對碳源、氮源代謝途徑中的特定代謝通路造成一定的影響。2單核細

5、胞增生性李斯特菌hfq基因缺失株生物學(xué)特性研究Hfq蛋白廣泛存在于革蘭陰性菌和某些革蘭陽性菌中，能同時調(diào)控大量靶標(biāo)基因的表鏖羞莖墊縫紲盥塑生世奎逝掛笪魚應(yīng)基國筮塞拯的掬建叢墓生物堂掛世班窺!ConstructionandcharacterizationofListeriamonocytogenesAhfqmutantstrainsMScandidate：MeiqinKangAdvisors：AssociateProfYuelanYinP

6、rofXin’anJiaoAbstractlIlllq11111qlllllLLIllIttlllillllllltlllY2632990GrampositivebrevibacteriumListeriamonocytogenes(Lm)isanimportantzoonoticfoodbomepathogenengaginginbothsaprophytismandparasitismAsafacultativeintracellu

7、larparasiticbacterium，LmhasrelativelybroadhostspectrumInaddition，ithasstrongabilitytoadapttocold，acid，alkalineandosmoticstress，therefore，itexistswidelyinnatureUnderdifferentenvironmentalstresschallenges，Lmcanadapt，surviv

8、eanddisplaypathogenicity，whichisassociatedwiththeregulatorynetworkconsistingofregulatingproteinsnfqproteinisanewlydiscoveredvirulenceregulatoryfactorofLm，andcurrentlyitislittleknownabouttheroleofHfqinbacterialgrowth，meta

9、bolismandvirulenceregulationTheecologicaldistributionandvirulenceofdifferentserotypesofLmareobviousvariations，wechosetheserotype1／2astandardstrainEGDeandserotype4bvirulentisolateNTSNastheparentalstrains，andsuccessfullyco

10、nstructeddeletionstrainsofhfqwithhomologousrecombinationtechnologyThentheabilityofstressresistanceandvirulencetomiceofdeletionmutantstrainswereevaluatedandcomparedwiththeirparentalstrains，inthiswaytheroleofLmHfqproteinin

11、thestresstoleranceandvirulencewasprobed1ConstructionandidentificationofhfqgenedeletedandreverselisterialstrainsBasedonhomologousrecombinationtechnology，wesuccessfullyconstructed物genemutantstrainsEGDeAhfqandNTSNAhfq，respe

12、ctivelyFirstlyhomologousfragmentsoftargetgenewereamplified，thensplicedtogetherwithSOEingPCRNextlythefusionfragmentsandshuttlevectorpKSV7weredigestedwithdoubleenzymesrespectivelythenpurified，ligatedandtransformedintocompe