豬繁殖與呼吸綜合征病毒M、N基因克隆及N基因表達(dá)應(yīng)用研究.pdf

1、豬繁殖與呼吸綜合征病毒(PRRSV)是引起豬繁殖障礙和呼吸道疫病的病原之一，病毒的M、N蛋白上具有保守性抗原位點(diǎn)，抗原性好。本研究進(jìn)行了PRRSVC14-2分離株M、N全基因的克隆分析，構(gòu)建了N基因的pET-32a-N原核表達(dá)載體，建立了以重組N蛋白為抗原檢測(cè)PRRS的間接ELISA方法。 實(shí)驗(yàn)參考PRRSV美洲型毒株VR2332株的基因序列，設(shè)計(jì)了M、N基因的特異性引物P1/P2及P3/P4，通過RT-PCR擴(kuò)增出PRRSVC

2、14-2分離株的M、N全基因。以pMD18-T為載體對(duì)M、N基因進(jìn)行了克隆。序列測(cè)定表明，M基因長(zhǎng)522bp，編碼174個(gè)氨基酸；N基因長(zhǎng)369bp，編碼128個(gè)核苷酸。序列分析表明，M基因與VR2332株和LV株核苷酸同源性分別為99.0％及67.8％，編碼氨基酸同源性分別為98.3％及77.5％；N基因與VR2332株和LV株的核苷酸同源性分別為99.7％及65.1％；編碼氨基酸同源性分別為99.2％及57.7％。進(jìn)化分析表明，C1

3、4-2株與美洲型毒株遺傳距離較近，從分子水平上證實(shí)了C14-2分離株屬于美洲型毒株。 將pMD18T-N中的N基因亞質(zhì)克隆進(jìn)pET-32a(+)，構(gòu)建了N基因的pET-32a-N原核表達(dá)載體，并將其轉(zhuǎn)化進(jìn)表達(dá)宿主菌E.coliBL21(DE3)中進(jìn)行誘導(dǎo)表達(dá)。表達(dá)產(chǎn)物經(jīng)SDS-PAGE電泳分析，獲得了一條約35kDa大小的濃縮蛋白帶。優(yōu)化實(shí)驗(yàn)確定了重組蛋白的最佳誘導(dǎo)表達(dá)條件：IPTG終濃度0.8～1.0mM，誘導(dǎo)時(shí)間3～4h。定

4、位分析表明融合蛋白以可溶性蛋白與不溶性蛋白兩種蛋白形式(包涵體)存在于細(xì)胞質(zhì)中。在變性及自然條件下分別以組氨酸純化試劑盒對(duì)重組表達(dá)蛋白進(jìn)行親合純化。蛋白質(zhì)免疫印跡試驗(yàn)結(jié)果顯示，重組表達(dá)蛋白與抗PRRSV的豬血清發(fā)生特異性反應(yīng)，表明其具有抗原活性。 以重組表達(dá)融合蛋白作為包被抗原，建立了診斷PRRS的間接ELISA方法。實(shí)驗(yàn)確定了最佳抗原包被濃度為3.99μg/ml，血清稀釋度為1：40。陽(yáng)性標(biāo)準(zhǔn)初步確立為：OD450＞0.293

5、。特異性實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，間接rN-ELISA與豬布氏桿菌病、豬瘟、豬大腸桿菌病、豬口蹄疫、豬細(xì)小病毒病、豬偽狂犬病陽(yáng)性血清不發(fā)生交叉反應(yīng)。重復(fù)性實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，間接rN-ELISA批內(nèi)與批間檢測(cè)樣品結(jié)果的平均變異系數(shù)分別為3.9493％及6.161％，表明重復(fù)性好。間接rN-ELISA與IDEXXHerdCheckELISA比較結(jié)果表明，間接rN-ELISA具有高敏感性及強(qiáng)特異性。 本論文研究進(jìn)行的PRRSVM、N基因克隆與分析，N