豬圓環(huán)病毒2型ORF2基因重組質(zhì)粒的制備及其對(duì)小鼠的免疫效應(yīng).pdf

1、質(zhì)粒的制備是分子生物學(xué)是最基本的操作之一。隨著DNA疫苗和基因重組藥物研究和應(yīng)用的快速發(fā)展，質(zhì)粒的需求量不斷地增加，常規(guī)的質(zhì)粒制備方法已經(jīng)不能滿(mǎn)足當(dāng)前的需要。在DNA疫苗方面，由于給動(dòng)物的免疫劑量不足，其效果不明顯，與傳統(tǒng)的疫苗相比，優(yōu)勢(shì)體現(xiàn)不出來(lái)，限制了其應(yīng)用。本文描述了一種獲取質(zhì)粒的新方法，在堿裂解方法的基礎(chǔ)上應(yīng)用過(guò)濾的方法除去蛋白質(zhì)和大的基因組DNA，首先用干酪包布過(guò)濾裂解液，異丙醇沉淀，然后再用孔徑為0.22 μm混合纖維素酯微

2、孔濾膜過(guò)濾濾液，并用70％的乙醇溶液進(jìn)行沖洗濾膜，自然風(fēng)干，然后用雙蒸水把質(zhì)粒DNA從濾膜上洗脫下來(lái)。該方法不僅適用于質(zhì)粒DNA的小量抽提，而且適用于500mL菌液的抽提，產(chǎn)量為、15 mg/L，得到質(zhì)粒DNA的OD260/280平均為1.89。并且該方法操作簡(jiǎn)單，操作過(guò)程中未用有毒有害的物質(zhì)，而且產(chǎn)量高，純度好，不僅可用于酶切、連接和轉(zhuǎn)化等分子生物學(xué)實(shí)驗(yàn)，還可以滿(mǎn)足核酸疫苗生產(chǎn)的需要。 豬圓環(huán)病毒2型(1)orcine cir

3、covirus type 2，PCV2)是引起豬斷奶后多系統(tǒng)衰竭綜合征及其它相關(guān)疾病的病原。本研究將表達(dá)豬圓環(huán)病毒2型ORF2基因的一套真核表達(dá)元件系統(tǒng)克隆插入到質(zhì)粒載體pMD-18T，構(gòu)建成pMD-T-ORF2，轉(zhuǎn)化入E.coli DH5a，用本試驗(yàn)室建立的方法提取質(zhì)粒，經(jīng)肌肉注射途徑對(duì)Balb/c小鼠分別在第1 d、第14 d和第28 d進(jìn)行免疫，用生理鹽水作對(duì)照，每周采血，對(duì)其抗體變化進(jìn)行監(jiān)測(cè)，在第56 d采取小鼠的脾淋巴細(xì)胞，用

4、淋巴細(xì)胞轉(zhuǎn)化試驗(yàn)，NK細(xì)胞殺傷活性試驗(yàn)，和對(duì)脾淋巴細(xì)胞中各細(xì)胞亞群的變化來(lái)觀(guān)察分析pMD-T-ORF2對(duì)Balb/c小鼠的細(xì)胞免疫的效果。結(jié)果表明，小鼠血清中特異性抗體水平略有上升，在第14 d達(dá)到峰值，但是雖然經(jīng)兩次加強(qiáng)免疫抗體水平并沒(méi)有顯著變化，從第56 d特異性抗體水平開(kāi)始出現(xiàn)下降趨勢(shì)；脾淋巴細(xì)胞體外增值能力實(shí)驗(yàn)組比對(duì)照組低，而且差異顯著(P<0.01)；免疫pMD-T-ORF2的小鼠脾臟NK細(xì)胞殺傷活性明顯比生理鹽水對(duì)照組高，自