吲哚胺2，3雙加氧酶轉(zhuǎn)染小鼠乳腺癌4T1細(xì)胞后的表達(dá)及作用.pdf

1、目的:
　　 通過建立小鼠乳腺癌模型研究吲哚胺2,3-雙加氧酶(Indoleamine2,3-dioxygenase,IDO)在乳腺癌遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移過程中發(fā)揮的作用及可能機(jī)制。
　　 檢測IDO轉(zhuǎn)染小鼠乳腺癌4T1細(xì)胞后的表達(dá)和意義。檢測轉(zhuǎn)染后的4T1細(xì)胞對免疫系統(tǒng)的抑制作用,尋找二者之間的聯(lián)系,并探討其引起轉(zhuǎn)移的可能機(jī)制。
　　 方法:
　　 1.建立4T1小鼠乳腺癌遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移模型,半定量RT-PCR法、Wes

2、ternblot和免疫組化法檢測未轉(zhuǎn)移和轉(zhuǎn)移小鼠腫瘤組織中IDO的表達(dá)情況。
　　 2.通過轉(zhuǎn)染攜帶IDO基因的目的質(zhì)粒建立高表達(dá)IDO的小鼠乳腺癌4T1細(xì)胞系,半定量RT-PCR和Westernblot檢測轉(zhuǎn)染后的4T1細(xì)胞中IDO的表達(dá)；轉(zhuǎn)染后的4T1細(xì)胞與小鼠脾臟T細(xì)胞共孵育,流式細(xì)胞儀檢測T細(xì)胞凋亡的比例；Westernblot法檢測共孵育后的T細(xì)胞Fas/FasL與Bcl-2/Bax基因的表達(dá)情況。
　　 結(jié)果

3、:
　　 1.半定量RT-PCR法檢測示4T1細(xì)胞不表達(dá)IDO,IFN-γ刺激也不能明顯上調(diào)IDO的表達(dá)。
　　 2.免疫組化法示發(fā)生轉(zhuǎn)移小鼠乳腺原發(fā)癌[(12.40±5.15)％]和轉(zhuǎn)移癌中[(14.28±6.46)％]IDO的陽性細(xì)胞指數(shù)均高于未發(fā)生轉(zhuǎn)移小鼠乳腺癌組織[(3.16±1.63)％](P<0.05),發(fā)生轉(zhuǎn)移小鼠乳腺癌轉(zhuǎn)移灶中IDO的表達(dá)水平高于原發(fā)癌,但沒有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(P>0.05)。半定量RT-PCR

4、法和Westernblot結(jié)果與免疫組化結(jié)果一致。
　　 3.調(diào)取IDO基因編碼序列(CDS)區(qū)域,克隆至pMD19-Tsimple載體中并測序后連入真核表達(dá)載體pIRES2-EGFP。BglⅡ/SalⅠ雙酶切重組質(zhì)粒pIRES2-EGFP-IDO,驗(yàn)證連接成功。
　　 4.將IDO真核表達(dá)載體pIRES2-EGFP-IDO通過脂質(zhì)體轉(zhuǎn)染小鼠乳腺癌4T1細(xì)胞,以轉(zhuǎn)染空質(zhì)粒組為對照。半定量RT-PCR法和Westernbl

5、ot檢測示轉(zhuǎn)染目的基因后的4T1細(xì)胞系IDO有表達(dá),而轉(zhuǎn)染對照質(zhì)粒后的4T1細(xì)胞系和未轉(zhuǎn)染的4T1細(xì)胞系IDO無表達(dá)。
　　 5.將脂轉(zhuǎn)目的基因、對照質(zhì)粒和未轉(zhuǎn)染的4T1細(xì)胞分別與小鼠脾臟分離T細(xì)胞共孵育,同時(shí)留取未共孵育的T細(xì)胞作對照,流式細(xì)胞儀檢測T細(xì)胞的凋亡率。共同培養(yǎng)48小時(shí)后,流式細(xì)胞儀檢測結(jié)果顯示與轉(zhuǎn)染目的基因IDO的4T1細(xì)胞共培養(yǎng)的CD3+T細(xì)胞(pIRES2-IDO-4T1/Tcells,以后均用此代指)凋亡率

6、為(47.07±6.13)％；與對照質(zhì)粒(pIRES2-EGFP-4T1/Tcells,以后均用此代指)和未轉(zhuǎn)染的4T1細(xì)胞(4T1-Tcells,以后均用此代指)共培養(yǎng)后的凋亡率分別為(35.56±4.26)％和(32.41±6.38)％；而正常培養(yǎng)的CD3+T細(xì)胞(simple-Tcells,106/mL,以后均用此代指)的凋亡率為(12.40±3.40)％。組間比較有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(P<0.05),而pIRES2-EGFP-4T1/T

7、cells和4T1-Tcells的凋亡率無統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(P>0.05),pIRES2-IDO-4T1/Tcells出現(xiàn)較為明顯的細(xì)胞凋亡。
　　 6.留取pIRES2-IDO-4T1/Tcells、pIRES2-EGFP-4T1/Tcells、4T1-Tcells和simple-Tcells這四組小鼠脾臟T細(xì)胞,分別檢測其Fas/FasL與Bcl-2/Bax蛋白的表達(dá)情況。Westernblot法檢測結(jié)果顯示Fas、FasL和Ba

8、x的蛋白表達(dá)在pIRES2-DO-4T1/Tcells、pIRES2-EGFP-4T1/Tcells和4T1-Tcells這三組T細(xì)胞中均有增加,其中pIRES2-IDO-4T1/Tcells這一組表達(dá)高于其它組(P<0.05),pIRES2-EGFP-4T1/Tcells和4T1-Tcells這兩組組間比較無統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(P>0.05),simple-Tcells這一組表達(dá)最低。而Bcl-2的蛋白表達(dá)在pIRES2-IDO-4T1/Tc

9、ells、pIRES2-EGFP-4T1/Tcells和4T1-Tcells這三組T細(xì)胞中均有降低,其中pIRES2-IDO-4T1/Tcells這一組表達(dá)低于其它組(P<0.05),pIRES2-EGFP-4T1/Tcells和4T1-Tcells這兩組組間比較無統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(P>0.05),simple-Tcells這一組表達(dá)最高。
　　 結(jié)論:
　　 1.發(fā)生轉(zhuǎn)移的乳腺原發(fā)癌和轉(zhuǎn)移癌中IDO的表達(dá)水平均高于未發(fā)生轉(zhuǎn)移