RNAi技術(shù)沉默吲哚胺2,3-雙加氧酶1對(duì)Lewis肺癌血管生成的影響.pdf

1、目的：
　　應(yīng)用RNA干擾（RNA interfering,RNAi）技術(shù)沉默吲哚胺2,3-雙加氧酶1（Indoleamine2,3-dioxygenase-1,IDO1），觀察沉默IDO1對(duì)Lewis肺癌細(xì)胞株（Lewis lung cancer cells,LLC）生物學(xué)特征的影響，并研究IDO1的短發(fā)夾RNA（short hairpin RNA,shRNA）IDO1-shRNA對(duì)肺癌荷瘤小鼠腫瘤的生長(zhǎng)及血管生成的影響，探討I

2、DO1與肺癌血管生成之間的關(guān)系，為肺癌的分子治療提供實(shí)驗(yàn)依據(jù)。
　　方法：
　　1、采用IDO1-siRNA（small interfering RNA,siRNA）沉默LLC細(xì)胞中的IDO1基因，通過實(shí)時(shí)熒光定量PCR法檢測(cè)IDO1 mRNA的表達(dá)變化，Western-blot法檢測(cè)IDO1蛋白的表達(dá)變化。
　　2、分別用侵襲實(shí)驗(yàn)、遷移實(shí)驗(yàn)以及基質(zhì)膠三維培養(yǎng)實(shí)驗(yàn)檢測(cè)沉默IDO1基因?qū)LC細(xì)胞的侵襲、遷移及血管擬態(tài)（

3、Vasculogenic mimicry,VM）形成能力的變化。
　　3、于C57BL/6小鼠背部皮下建立肺癌荷瘤小鼠模型，采用尾靜脈高壓注射50μg IDO1-shRNA的方法進(jìn)行抗腫瘤治療，每天觀察并記錄其對(duì)腫瘤生長(zhǎng)的影響。
　　4、利用免疫組化的方法分別檢測(cè)小鼠腫瘤組織中IDO1及CD34、CD146分別標(biāo)記的微血管密度（Microvessel density,MVD;CD34+MVD,CD146+MVD）的表達(dá)變化，

4、并分析IDO1與CD34+MVD、CD146+MVD之間的相關(guān)性。
　　結(jié)果：
　　1、實(shí)時(shí)熒光定量PCR、Western-blot結(jié)果顯示，LLC細(xì)胞經(jīng)轉(zhuǎn)染IDO1-siRNA后，IDO1 mRNA表達(dá)水平及蛋白表達(dá)水平明顯下降，IDO1基因的沉默效率可達(dá)80％以上。
　　2、侵襲實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，沉默IDO1后的LLC細(xì)胞其侵襲能力明顯被抑制；遷移實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，IDO1基因沉默后的LLC細(xì)胞其遷移能力明顯減弱；此外，基

5、質(zhì)膠三維培養(yǎng)實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，IDO1基因沉默后的LLC細(xì)胞生成血管擬態(tài)的管狀結(jié)構(gòu)數(shù)目明顯減少。
　　3、肺癌荷瘤小鼠經(jīng)全身系統(tǒng)性給予 IDO1-shRNA治療后，與Scramble-shRNA、Control組相比，IDO1-shRNA治療組腫瘤的生長(zhǎng)速度明顯減慢、腫瘤的大小明顯減小、腫瘤的重量明顯減輕。
　　4、免疫組化結(jié)果顯示，IDO1-shRNA治療組小鼠腫瘤組織中IDO1及CD34+MVD、CD146+MVD的表達(dá)均明

6、顯下降，且IDO1與CD34+MVD、CD146+MVD均具有相關(guān)性(r2=0.8632,r2=0.761)。
　　結(jié)論：
　　1、LLC細(xì)胞中的IDO1基因被沉默后，其部分生物學(xué)特征明顯發(fā)生了改變，如：細(xì)胞的侵襲、遷移、血管擬態(tài)形成能力均被抑制了。
　　2、IDO1-shRNA能夠抑制小鼠肺癌的血管生成，同時(shí)有效抑制腫瘤的生長(zhǎng)。
　　3、小鼠腫瘤組織中IDO1表達(dá)水平的高低與CD34+MVD、CD146+MVD