吲哚胺2,3-雙加氧酶轉(zhuǎn)染骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞誘導(dǎo)移植免疫耐受的實(shí)驗(yàn)研究.pdf

1、背景:隨著各種新型免疫抑制劑的問(wèn)世，移植外科技術(shù)的進(jìn)步，器官移植已經(jīng)成為了治療器官功能衰竭最佳的方案。然而，器官移植術(shù)后長(zhǎng)期、量使用免疫抑制劑所導(dǎo)致的嚴(yán)重副作用（如重癥感染、骨髓抑制、糖代謝紊亂等）卻顯著影響了移植受體的長(zhǎng)期生存。因此，如何誘導(dǎo)受體產(chǎn)生供體特異性免疫耐受，減少免疫抑制劑的大量使用，成為了移植免疫界一直以來(lái)的研究重點(diǎn)。
　　結(jié)合既往研究結(jié)果，上述問(wèn)題的關(guān)鍵可能在于野生型骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞的免疫抑制作用相對(duì)低下。因此，如

2、何增強(qiáng)骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞的免疫抑制作用，使其在安全劑量范圍內(nèi)即可達(dá)到理想的免疫抑制效應(yīng);增強(qiáng)骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞的免疫抑制作用后是否可誘導(dǎo)受體免疫耐受形成，成為了本實(shí)驗(yàn)的研究的方向。
　　目的:通過(guò)慢病毒轉(zhuǎn)染技術(shù)，將兔源性IDO基因轉(zhuǎn)入兔骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞內(nèi)，增強(qiáng)MSCs的免疫抑制作用，誘導(dǎo)CD4+CD25+ Tregs生成。并通過(guò)上調(diào)Tregs對(duì)抑制性協(xié)同刺激分子CTLA-4及免疫抑制性細(xì)胞因子IL-10、 TGF-β的表達(dá)，提升Tre

3、gs的抗原特異性免疫抑制作用，從而防治急性排斥反應(yīng)，誘導(dǎo)供體特異性移植免疫耐受的形成。
　　方法:
　　1.兔骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞的分離與培養(yǎng):
　　因家兔屬?lài)X科動(dòng)物，各品系遺傳穩(wěn)定，且便于腎移植手術(shù)的實(shí)施，故本研究采用家兔骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞及移植模型作為研究對(duì)象。骨穿針穿取兔股骨獲得骨髓懸液。密度梯度離心法獲取骨髓懸液中單個(gè)核細(xì)胞層。于DMEM/F12完全培養(yǎng)基內(nèi)貼壁生長(zhǎng)兩天后去除懸浮細(xì)胞，繼續(xù)培養(yǎng)七天后傳代。
　

4、　2.攜帶IDO基因慢病毒的構(gòu)建:
　　GenBank搜索獲得兔源性IDO基因序列信息。RT-PCR擴(kuò)增、純化IDO序列。酶切消化慢病毒載體質(zhì)粒GV218后，將擴(kuò)增的IDO序列與之拼接，挑選陽(yáng)性克隆(pGC-FU-GFP-IDO)。純化的陽(yáng)性克隆質(zhì)粒與載體質(zhì)粒pHelper1.0及pHelper2.0共同轉(zhuǎn)染入293細(xì)胞內(nèi)，使目的基因與慢病毒載體在293細(xì)胞內(nèi)重組整合為攜帶IDO基因的慢病毒(pGC-FU-GFP-IDO lent

5、ivirus)。
　　3.慢病毒感染骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞:
　　感染前12小時(shí)消化調(diào)整MSCs密度為4.5×103/孔，將其于六孔板內(nèi)貼壁培養(yǎng)12小時(shí)后加入1ml含ploy brene的增強(qiáng)感染液及空載慢病毒(pGC-FU-GFP lentivirusMOI=100)或IDO陽(yáng)性慢病毒(pGC-FU-GFP-IDO lentivirus MOI=120)。待細(xì)胞貼壁長(zhǎng)滿(mǎn)后加入20ug Fe/ml Molday ION Rhoda

6、mine B繼續(xù)培養(yǎng)12小時(shí)。消化上述MSCs并制懸，以備動(dòng)物模型注射使用。
　　結(jié)果:
　　1.兔骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞的分離與培養(yǎng):
　　采集的骨髓細(xì)胞經(jīng)培養(yǎng)3小時(shí)后開(kāi)始貼壁，48小時(shí)后貼壁細(xì)胞變形，呈典型的紡錘體狀或纖維細(xì)胞樣生長(zhǎng)。培養(yǎng)六天后原代MSCs融合達(dá)80％，予傳代。傳代細(xì)胞培養(yǎng)三天后，細(xì)胞融合即可達(dá)80％以上，可穩(wěn)定傳代生長(zhǎng)。
　　2.IDO基因慢病毒的構(gòu)建及MSCs轉(zhuǎn)染:
　　質(zhì)粒載體GV218

7、經(jīng)AgeI酶切后，加入擴(kuò)增IDO序列（PCR產(chǎn)物大小:1243bp）構(gòu)建重組質(zhì)粒。重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)染293T細(xì)胞后于細(xì)胞內(nèi)合成陽(yáng)性克隆慢病毒并分泌于外周培養(yǎng)基內(nèi)。收集病毒上清并提純，最終病毒滴度檢測(cè)結(jié)果為2×108 TU/ml。
　　第三代(P3) MSCs按MOI=100及120分別感染空載病毒pGC-FU-GFP及IDO陽(yáng)性病毒pGC-FU-GFP-IDO24小時(shí)后，于倒置熒光顯微鏡下觀察到貼壁細(xì)胞發(fā)出淺淡綠色熒光，細(xì)胞感染率20％

8、-30％。96小時(shí)后熒光強(qiáng)度達(dá)峰，80％以上MSCs高強(qiáng)度表達(dá)綠色熒光蛋白。
　　3.IDO慢病毒轉(zhuǎn)染MSCs穩(wěn)定高表達(dá)IDO蛋白:
　　慢病毒轉(zhuǎn)染MSCs全細(xì)胞裂解后經(jīng)免疫蛋白印跡(Westernblot)分析，在500IU/mlIFN-γ作用下，野生型及空載病毒轉(zhuǎn)染MSCs極低水平表達(dá)IDO蛋白，而pGC-FU-GFP-IDO病毒轉(zhuǎn)染MSCs可穩(wěn)定高表達(dá)IDO蛋白（分子量大小43KDa）。
　　結(jié)論:
　　1

9、、慢病毒載體可將兔源性IDO基因成功轉(zhuǎn)入兔骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞，并使兔骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞穩(wěn)定、持續(xù)、高水平表達(dá)IDO蛋白。
　　2、IDO轉(zhuǎn)染骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞后，可增強(qiáng)骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞對(duì)效應(yīng)性T細(xì)胞的直接免疫抑制作用。
　　3、IDO轉(zhuǎn)染骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞后可增強(qiáng)骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞誘導(dǎo)CD4+CD25+ Tregs生成的作用。同時(shí)，IDO轉(zhuǎn)染的骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞通過(guò)上調(diào)Treg表達(dá)的CTLA-4及IL-10、TGF-β而增強(qiáng)Tregs的

10、抗原特異性免疫抑制效應(yīng)。
　　4、IDO轉(zhuǎn)染的骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞可通過(guò)誘導(dǎo)CD4+CD25+ Tregs的生成并增強(qiáng)Tregs的免疫抑制作用，一定程度內(nèi)減輕急性排斥反應(yīng)，延長(zhǎng)受體生存時(shí)間，誘導(dǎo)部分受體形成供體特異性移植免疫耐受。
　　綜上所述，慢病毒介導(dǎo)的基因轉(zhuǎn)染技術(shù)可有效將兔源IDO基因轉(zhuǎn)入兔骨髓間充干細(xì)胞內(nèi)，并使其高水平表達(dá)IDO蛋白，從而增強(qiáng)骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞的免疫抑制作用，誘導(dǎo)CD4+CD25+ Tregs生成，并增強(qiáng)C