腺病毒介導TIMP-4基因轉染對血管平滑肌細胞生物學行為的影響.pdf

1、背景和目的:血管新生內膜形成是PTCA和支架術后RS的病理基礎,VSMC的遷移則是新生內膜形成的關鍵步驟,必須首先突破ECM的束縛方能穿過內彈力膜發(fā)生遷移形成新生內膜.ECM的穩(wěn)定是維持血管壁完整性的重要基礎,MMPs及其組織抑制因子TIMPs是維持ECM穩(wěn)態(tài)最重要的蛋白酶家族.血管損傷后,受損血管局部的VSMC在各種細胞因子的刺激下發(fā)生細胞表型的改變,由收縮型轉變?yōu)楹铣尚?分泌大量的MMPs,打破了維持ECM穩(wěn)態(tài)的MMPs/TIMPs

2、動態(tài)平衡,分泌到胞外的MMPs使ECM蛋白發(fā)生降解,從而解除了ECM對VSMC的束縛,打通了VSMC遷移的道路,因此,MMPs可能在新生內膜形成過程中扮演了分子開關的角色.由此可見,維持MMPs與TIMPs之間的動態(tài)平衡是十分重要的.近年來的一些研究證實,血管損傷時局部過表達TIMP-l、TIMP-2和TIMP-3均可明顯減少VSMC遷移、抑制新生內膜增生.TIMP-4作為TIMPs家族的新成員,表達具有心臟特異性.目前關于TIMP-4

3、生物學功能的研究報道較少,是否也會對VSMC的遷移與增殖產生影響,尚未見報道.該實驗構建了攜帶TIMP-4基因的重組腺病毒載體,通過轉染體外培養(yǎng)的大鼠VSMC,研究增強其表達對VSMC增殖、遷移等生物學行為的影響,以進一步明確TIMP-4的生物學活性,為TIMP-4在RS防治研究中的應用提供理論依據和實驗證據.方法:①采用位置特異性重組方法構建攜帶人TIMP-4基因表達序列的復制缺陷型5型腺病毒載體,經293細胞擴增,純化制備高滴度病毒

4、轉染液.將獲贈的對照病毒Ad.LacZ以相同方法進行擴增和純化;②采用組織塊貼壁法原代培養(yǎng)大鼠主動脈VSMC,以形態(tài)學和免疫細胞化學鑒定;③以病毒轉染液常規(guī)轉染VSMC后,應用RT-PCR、免疫細胞化學和蛋白免疫印跡等方法分別檢測TIMP-4基因在VSMC轉錄和翻譯水平的表達;④以酶譜法(zymography)和逆向酶譜法(reverse zymography)檢測VSMC表達分泌的TIMP-4的蛋白活性;⑤應用帶Matrigel基底膜

5、基質的Millicell培養(yǎng)小室研究TIMP-4表達對VSMC遷移的影響,應用四唑鹽(MTT)比色實驗、3H標記的胸腺嘧啶核苷(3H-TdR)摻入實驗、流式細胞儀等檢測TIMP-4表達對VSMC增殖的影響; 結果:①應用DNA重組技術,成功構建了攜帶TIMP-4基因的重組穿梭質粒載體pDC315.TIMP-4,將其與腺病毒基因組質粒pBHGlox△E1,3cre在脂質體介導下共轉染293細胞,通過位置特異性重組,經PCR法篩選、鑒定,成

6、功獲得了攜帶TIMP-4基因的人類5型復制缺陷型腺病毒Ad.TIMP-4.構建的Ad.TIMP-4通過大量復制和純化,獲得滴度約5×10<'10>pfu/ml.對照病毒Ad.LacZ經擴增、純化,獲得滴度為7.5×1010pfu/ml.Ad.TIMP-4和Ad.LacZ的最佳轉染復數均為100MOI;②采用組織塊貼壁法原代培養(yǎng)大鼠主動脈VSMC,經形態(tài)學和免疫細胞化學鑒定證實為VSMC,6~8代時VSMC純度幾近100﹪;③通過RT-P

7、CR、免疫細胞化學法和蛋白免疫印跡等方法表明,正常培養(yǎng)的VSMC不表達TIMP-4,Ad.TIMP-4轉染VSMC后檢測TIMP-4細胞表達率、mRNA和蛋白表達的結果均證明VSMC成功表達了TIMP-4,表達率隨轉染時間延長逐漸增加,轉染后2d可達86.5﹪,高水平的表達可維持6d以上;④酶譜法和逆向酶譜法結果證明Ad.TIMP-4轉染VSMC后表達分泌的TIMP-4具有抑制MMPs的生物學活性.在實驗過程中對檢測TIMP-4生物學活

8、性的酶譜法和逆向酶譜法進行了優(yōu)化;⑤Ad.TIMP-4轉染VSMC后,TIMP-4表達可顯著抑制PDGF趨化作用引起的VSMC遷移,并且隨轉染時間的延長,TIMP-4表達增多,遷移的VSMC數呈更加減少的趨勢.與Ad.LacZ組相比,VSMC遷移數最大減少78.7﹪;⑥Ad.TIMP-4轉染VSMC后,TIMP-4表達可顯著抑制VSMC增殖.與Ad.LacZ組相比,MTT吸光度降低最大達47.1﹪,3H-TdR摻入量降低最大達30.7﹪

9、,G<,0>-G<,1>期的VSMC比例顯著增高,G1- M期和S期細胞比例顯著降低; 結論:①用構建的復制缺陷型腺病毒Ad.TIMP-4轉染培養(yǎng)的大鼠主動脈VSMC, 可使TIMP-4在VSMC中高效表達,并具有生物學活性;②Ad.TIMP-4轉染VSMC后,TIMP-4的表達可顯著抑制VSMC的遷移和增殖;③TIMP-4對VSMC生物學行為的影響為RS的基因防治研究提供了新的思路;④用改建的PTCA球囊建立了大鼠頸總動脈新生內膜增殖