腺病毒介導(dǎo)的血管緊張素Ⅱ1型受體相關(guān)蛋白對(duì)血管平滑肌細(xì)胞增殖與凋亡的影響及機(jī)制.pdf

1、背景和目的：
　　心腦血管疾病是發(fā)達(dá)國(guó)家與發(fā)展中國(guó)家目前常見(jiàn)的死因。動(dòng)脈粥樣硬化（Atherosclerosis,AS）是一種多因素慢性疾病，到目前為止其危險(xiǎn)因素已發(fā)現(xiàn)多種，仍在不斷增加。AS的發(fā)展病理變化過(guò)程分為三個(gè)階段：第一階段為脂紋形成，第二階段為纖維斑塊形成，第三階段為粥樣斑塊形成。目前對(duì)于動(dòng)脈粥樣硬化造成的血管病變主要有經(jīng)皮血管成型術(shù)和動(dòng)脈搭橋術(shù)這兩種治療方法，雖然上述治療方法技術(shù)已經(jīng)很成熟，但是術(shù)后出現(xiàn)血管吻合口處內(nèi)膜

2、增生、支架內(nèi)再狹窄等并發(fā)癥，使患者不能長(zhǎng)期受益于這種治療，從而導(dǎo)致較高的死亡率。
　　腎素-血管緊張素-醛固酮系統(tǒng)（Rennin-angiotensin-aldosteronesystem，RAAS）是人體重要的體液調(diào)節(jié)系統(tǒng)，它能夠調(diào)節(jié)水鹽平衡、血管張力和交感神經(jīng)活性。血管緊張素Ⅱ（Angiotensin II,Ang II）是其重要的效應(yīng)分子，參與動(dòng)脈粥樣硬化的形成，它需要通過(guò)其受體發(fā)揮生物學(xué)效應(yīng)，主要是1型Ang II受體（A

3、T1R）介導(dǎo)了Ang II大多數(shù)作用。受體激活后能夠促進(jìn)血管內(nèi)皮細(xì)胞增生，刺激細(xì)胞產(chǎn)生大量的生長(zhǎng)因子、趨化因子和細(xì)胞因子，促進(jìn)炎細(xì)胞浸潤(rùn)，誘導(dǎo)強(qiáng)大的血管炎癥反應(yīng)。此外，AT1R的激活也能導(dǎo)致NF-κB轉(zhuǎn)移到細(xì)胞核內(nèi)，使細(xì)胞轉(zhuǎn)錄和翻譯活動(dòng)增加，促進(jìn)血管平滑肌細(xì)胞（VSMC）遷移和增殖。所以AT1R基因自然就成為研究動(dòng)脈粥樣硬化的重要侯選基因。
　　近幾年Dzau,V.J克隆出了AngII的1型受體相關(guān)蛋白（Angiotensin I

4、I Type I Receptor-Associated Protein，ATRAP)，目前研究已經(jīng)證實(shí)了ATRAP基因參與RAAS的調(diào)控，加強(qiáng)VSMC上AT1R的內(nèi)化，故拮抗了AT1R介導(dǎo)的Ang II的生物學(xué)效應(yīng)，能夠明顯抑制VSMC的增殖。盡管如此，ATRAP作為血管疾病治療方法中新的靶基因，其在作用于Ang II介導(dǎo)的血管疾病中確切的分子機(jī)制仍不明確。
　　隨著科技的進(jìn)步，基因治療越來(lái)越受到人們的重視。目前已報(bào)道的基因治療

5、有很多種，但效果均不盡人意。所以，利用基因傳遞系統(tǒng)，我們有意將目的基因在直接暴露的手術(shù)部位轉(zhuǎn)入到細(xì)胞內(nèi)，上調(diào)能夠抑制動(dòng)脈粥樣硬化發(fā)病的有關(guān)基因，可能抑制血管炎癥反應(yīng)和血管內(nèi)膜增生，將可能會(huì)成為治療動(dòng)脈粥樣硬化最可靠的方法。常用的基因載體系統(tǒng)有逆轉(zhuǎn)錄病毒、脂質(zhì)體等，本實(shí)驗(yàn)選用的是感染效率較強(qiáng)的腺病毒載體。
　　本研究旨在構(gòu)建小鼠ATRAP的重組腺病毒pAD-ATRAP-HIS*6作用于離體培養(yǎng)的VSMC和大鼠頸動(dòng)脈損傷模型上，以VS

6、MC的增殖、凋亡情況、凋亡家族基因bax和bcl-2的表達(dá)量和對(duì)血管內(nèi)膜增生的改變?yōu)橛^察檢測(cè)指標(biāo)，評(píng)價(jià)腺病毒介導(dǎo)的ATRAP感染VSMC的效率，論證ATRAP基因?qū)SMC增殖與凋亡的影響及其引起VSMC凋亡的分子作用機(jī)制。
　　方法：
　　本實(shí)驗(yàn)利用腺病毒載體負(fù)載ATRAP，利用腺病毒感染體外培養(yǎng)的VSMC和大鼠損傷的頸總動(dòng)脈。①構(gòu)建腺病毒 pAD-ATRAP-HIS*6,檢測(cè)其滴度與感染能力。②體外實(shí)驗(yàn)：利用腺病毒介導(dǎo)的

7、ATRAP感染VSMC，觀察ATRAP對(duì)體外培養(yǎng)的VSMC的增殖與凋亡作用。③體內(nèi)實(shí)驗(yàn)：用球囊損傷大鼠頸動(dòng)脈建立內(nèi)膜損傷增生的模型，用腺病毒感染損傷動(dòng)脈，觀察ATRAP對(duì)增生內(nèi)膜的抑制作用。
　　結(jié)果：
　　1.成功構(gòu)建腺病毒pAD-ATRAP-HIS*6，滴度為1.34×109LFU/mL。
　　2.體外感染腺病毒的VSMC中觀察到ATRAP的mRNA和蛋白的高水平表達(dá)。
　　3.在Ang II刺激后的VSMC

8、中感染腺病毒，觀察到ATRAP能夠抑制VSMC的增殖。
　　4.在Ang II刺激后的VSMC中感染腺病毒，觀察到ATRAP能夠促進(jìn)VSMC的凋亡，并且觀察到凋亡蛋白bax的mRNA水平和蛋白水平的高表達(dá)和抗凋亡蛋白bcl-2的mRNA水平和蛋白水平的低表達(dá)。
　　5.在損傷動(dòng)脈處感染ATRAP觀察到內(nèi)膜增生減少，而對(duì)照組內(nèi)膜增生嚴(yán)重。
　　結(jié)論：
　　ATRAP能夠明顯抑制AT1R介導(dǎo)的VSMC的增殖,促進(jìn)VS