Profilin-1在血管緊張素Ⅱ介導的平滑肌細胞增殖中的作用.pdf

1、第一章自發(fā)性高血壓大鼠中profilin-1的表達。
　　 研究目的：
　　 Profilin-1是一種小分子量的肌動蛋白結(jié)合蛋白，廣泛存在于除骨骼肌之外的機體組織，可調(diào)節(jié)肌動蛋白聚合及解聚過程；參與調(diào)節(jié)細胞的增殖、分化和運動過程以及信號轉(zhuǎn)導。許多研究顯示，profilin-1在冠心病、高血壓、糖尿病等心血管疾病的發(fā)生中起重要作用。有研究顯示過表達profilin-1的FVB/N小鼠主動脈profilin-1蛋白水平增加

2、，主動脈血管壁出現(xiàn)明顯的肥厚征兆，且profilin-1過表達小鼠從出生后6個月開始收縮壓和平均動脈壓顯著增高。
　　 方法：
　　 選取12周齡雄性自發(fā)高血壓大鼠24只，隨機分為三組，即SHR組，低劑量氯沙坦組(Los(L))及高劑量氯沙坦組(Los(H))每組8只；以性別、周齡匹配的WKY(Wistar Kyoto rats)大鼠8只作為對照。其中Los(L)組給予15mg/kg/d的氯沙坦灌胃，Los(H)組給予3

3、0mg/kg/d的氯沙坦灌胃，SHR組及WKY組給予等體積的生理鹽水灌胃，常規(guī)喂養(yǎng)至20周后終止實驗。開始及每周測量大鼠尾動脈壓。實驗結(jié)束后，抽血分離血漿檢測血管緊張素Ⅱ(AngiotensionⅡ，AngⅡ)，麻醉后取胸主動脈及腸系膜三級動脈，行蘇木精-伊紅(hematoxylin-eosin staining，HE)染色。利用計算機輔助成像系統(tǒng)測算動脈中層厚度(media thickness，MT)，管腔直徑(lumen diame

4、ter，LD)，厚度/腔徑(MT/MD)，動脈中膜細胞平均核面積，免疫組織化學染色檢測profilin-1抗原在動脈壁的表達。提取胸主動脈mRNA及蛋白，采用Real-Time PCR及Western-Blot方法測量大鼠胸主動脈profilin-1 mRNA及蛋白的表達。
　　 結(jié)果：
　　 1、SHR組收縮期血壓(systolic blood pressure，SBP)明顯高于WKY組(P<0.01)，Los(L)組

5、及Los(H)組SBP較同期SHR者明顯降低，且Los(H)組SBP降低幅度更大(P<0.01)。
　　 2、處理結(jié)束后檢測SHR大鼠血漿AngⅡ水平明顯高于WKY組(P<0.01)，Los(L)組及Los(H)組，AngⅡ較SHR組明顯升高，且Los(H)組升高幅度更大(P<0.01)。
　　 3、HE染色顯示SHR組胸主動脈及腸系膜動脈重構(gòu)明顯，Los(L)組及Los(H)組結(jié)果顯示氯沙坦可部分防止高血壓的血管重構(gòu)。

6、SHR組腸系膜動脈MT、LD、MT/LD及中膜血管平滑肌細胞(Vascular smooth muscle cells，VSMCs)平均核面積較WKY組大鼠顯著增大，Los(L)組及Los(H)組結(jié)果顯示氯沙坦可部分預防重構(gòu)發(fā)生。
　　 4、SHR胸主動脈及腸系膜動脈profilin-1染色明顯高于WKY組，Los(L)組及Los(H)組結(jié)果顯示氯沙坦可降低SHR動脈profilin-1的表達。
　　 5、SHR胸主動脈

7、profilin-1 mRNA及蛋白表達明顯高于WKY大鼠(P<0.05)，Los(L)組及Los(H)組profilin-1 mRNA表達介于SHR組與WKY組之間。
　　 結(jié)論：
　　 SHR大鼠胸主動脈及腸系膜動脈profilin-1表達明顯增加，氯沙坦治療可降低profilin-1表達。
　　 第二章 AngⅡ干預平滑肌細胞后profilin-1表達變化。
　　 研究目的：
　　 在高血壓

8、發(fā)病過程中血管重構(gòu)是其重要特征，包括內(nèi)皮功能失調(diào)，血管平滑肌細胞增生，血管內(nèi)徑明顯減少，中膜橫截面積增加，平均細胞核面積增加等。
　　 血管緊張素Ⅱ在正常情況下對維持血壓有良好的作用，但是在病理情況下，產(chǎn)生過多時會引起血壓升高及心臟及血管重構(gòu)，從而導致靶器官的損害。
　　 本文第一章研究提示在SHR中，可見血漿AngⅡ水平明顯升高，胸主動脈及腸系膜動脈存在明顯的血管重構(gòu)及profilin-1表達增加，氯沙坦處理可部分抑制

9、血管重構(gòu)及profilin-1的增加。
　　 本章采用外源性AngⅡ干預大鼠血管平滑肌細胞株(rat vascularsmooth muscle cells，RVSMC)，觀察RVSMC細胞增殖情況及profilin-1的表達情況，并采用氯沙坦干預觀察其對RVSMC細胞增殖情況及profilin-1表達的影響，以進一步明確profilin-1在平滑肌細胞增殖中是否起作用。
　　 方法：
　　 培養(yǎng)大鼠血管平滑肌細

10、胞株，分別用不同濃度(0，10-8M，10-7M，10-6M)AngⅡ處理不同時間(6h，12h，18h，24h)，采用MTT法及流式細胞儀測定細胞周期法觀察大鼠血管平滑肌細胞的增殖情況；采用Western-Blot法檢測大鼠血管平滑肌細胞profilin-1蛋白的表達。低劑量(10-6M)及高劑量(10-5M)氯沙坦預處理大鼠血管平滑肌細胞1h后給予AngⅡ終濃度10-6M處理24h，采用MTT法及流式細胞儀測定細胞周期法觀察大鼠血管

11、平滑肌細胞的增殖情況；采用Western-Blot法檢測大鼠血管平滑肌細胞profilin-1蛋白的表達。
　　 結(jié)果：
　　 1、AngⅡ可呈濃度及劑量依賴性的促進大鼠血管平滑肌細胞的增殖，以10-6MAngⅡ處理大鼠血管平滑肌細胞24h后最為顯著。
　　 2、氯沙坦預處理大鼠血管平滑肌細胞1h后，加入10-6M AngⅡ繼續(xù)處理細胞24h后，可見大鼠平滑肌細胞增殖能力明顯下降。
　　 3、AngⅡ可呈

12、濃度及劑量依賴性的上調(diào)大鼠血管平滑肌細胞profilin-1的表達，以10-6M AngⅡ處理大鼠血管平滑肌細胞24h后最為顯著。
　　 4、氯沙坦預處理大鼠血管平滑肌細胞1h后，加入10-6M AngⅡ繼續(xù)處理細胞24h后，可見氯沙坦可顯著抑制AngⅡ誘導的profilin-1蛋白的表達。
　　 結(jié)論：
　　 AngⅡ可呈濃度及劑量依賴性的上調(diào)大鼠血管平滑肌細胞profilin-1的表達，氯沙坦預處理可顯著抑制

13、AngⅡ誘導的profilin-1蛋白的表達。
　　 第三章沉默profilin-1基因后AngⅡ處理平滑肌細胞后功能變化：
　　 研究目的：
　　 RNA干擾(RNA interference，RNAi)是指由外源或內(nèi)源性的雙鏈RNA(double strand RNA，dsRNA)導入細胞而引起的與dsRNA同源的mRNA降解，進而抑制相應(yīng)的基因表達。本章采用RNA干擾技術(shù)將大鼠血管平滑肌細胞內(nèi)profili

14、n-1基因沉默后，觀察AngⅡ?qū)π碌募毎翟鲋彻δ艿挠绊懀M一步明確profilin-1在大鼠血管平滑肌細胞增殖中的作用，進而為研究高血壓血管霞構(gòu)的機制提供新的思路。
　　 JAK/STAT信號轉(zhuǎn)導途徑是一種壓力反應(yīng)性途徑，一般情況信號通過細胞表面受體傳入細胞核，進而調(diào)節(jié)基因表達。有研究顯示AngⅡ可通過結(jié)合AngⅡ受體而激活JAK家族中的JAK2和TYK2，進而使STAT蛋白的磷酸化水平增強(STAT1α/h，STAT2 an

15、d STAT3)。另有研究指出JAK2在AngⅡ誘導的平滑肌細胞增殖中期關(guān)鍵作用。本章研究了阻斷JAK2/STAT3途徑對AngⅡ誘導的平滑肌細胞增殖的影響及對profilin-1表達的影響，初步探討profilin-1影響血管平滑肌細胞增殖的機制。
　　 方法：
　　 培養(yǎng)大鼠血管平滑肌細胞株，并由上海吉凱基因化學技術(shù)有限公司合成profilin-1 siRNA質(zhì)粒，采用FuGENE HD轉(zhuǎn)染試劑將profilin-1

16、siRNA質(zhì)粒成功轉(zhuǎn)染大鼠血管平滑肌細胞株，采用Real-Time PCR及Western-Blot法檢測profilin-1基因沉默效果；AngⅡ以終濃度10-6M處理該細胞系，采用MTT法及流式細胞儀測定細胞周期法觀察大鼠血管平滑肌細胞的增殖情況。JAK2/STAT3信號轉(zhuǎn)導途徑抑制劑預處理正常大鼠血管平滑肌細胞株1h后給予AngⅡ終濃度10-6M處理24h，采用MTT法及流式細胞儀測定細胞周期法觀察大鼠血管平滑肌細胞的增殖情況；采

17、用Western-Blot法檢測大鼠血管平滑肌細胞profilin-1蛋白的表達。
　　 結(jié)果：
　　 1、利用FuGENE HD轉(zhuǎn)染試劑成功建立了profilin-1基因沉默的大鼠血管平滑肌細胞株，其profilin-1基因表達明顯下調(diào)。
　　 2、沉默profilin-1基因后，AngⅡ誘導平滑肌細胞增殖能力下降。
　　 3、采用JAK/STAT3抑制劑阻斷JAK/STAT3信號轉(zhuǎn)導途徑后，AngⅡ誘