產(chǎn)DCase的基因工程菌發(fā)酵及酶固定化工藝研究.pdf

1、本實(shí)驗(yàn)菌種spMF0507是產(chǎn)DHase和DCase的野生菌，而DHase活力遠(yuǎn)遠(yuǎn)大于DCase，因此可以通過控制適當(dāng)pH值，使DCase失活，而保留DHase活力生產(chǎn)NC-D-pHPG。此外還有一菌種Espf7是克隆了DCase基因的大腸桿菌，它能表達(dá)DCase活性繼續(xù)將NC-D-pHPG轉(zhuǎn)化為D-pHPG，可DCase是胞內(nèi)酶，故需要對(duì)其進(jìn)行細(xì)胞破碎才能釋放出酶。另外利用正交法對(duì)spMF0507的培養(yǎng)基組成和發(fā)酵培養(yǎng)條件也進(jìn)行了研究

2、，之后把發(fā)酵優(yōu)化結(jié)果投入5升發(fā)酵罐進(jìn)行驗(yàn)證。最后對(duì)工程菌Espf7發(fā)酵后提取的酶進(jìn)行了固定化研究，通過測(cè)定蛋白質(zhì)含量和酶活力來確定固定化結(jié)果。以下是整個(gè)實(shí)驗(yàn)結(jié)果： (1)菌種spMF0507的適宜接種齡是20～24h，pH值控制在9.0～9.5時(shí)，可以使DCase失活，DHase活力仍有0.2u·mL-1，在該條件下來制備NC-D-pHPG。但轉(zhuǎn)化過程中，NC-D-pHPG容易被氧化成紅色物質(zhì)，而通氮?dú)饽芊乐蛊浔谎趸?。提取NC-

3、D-pHPG時(shí)加入2％的丙酮能加快結(jié)晶速度，結(jié)晶率達(dá)到97.9％，NC-D-pHPG的純度達(dá)98.5％。 (2)基因工程菌Espf7在0.02％的氯仿用量下可以通透細(xì)胞膜，適宜接種齡為16～20h，接種量2％，初始pH值7.0，培養(yǎng)溫度30℃，阿拉伯糖0.01％；甘油0.30％；玉米漿3％；NaCL0.2％；KH2PO40.05％；MgSO40.05％；MnCL20.02％；CoCL20.01％，使DCase活力由1.12u·m

4、L-1提高到2.1u·mL-1，提高了87.5％。在發(fā)酵罐上控制條件溫度30℃、轉(zhuǎn)速500r/min，pH設(shè)定在7.0來補(bǔ)料，結(jié)果活力提高到3u·mL-1。 (3)均質(zhì)機(jī)破碎細(xì)胞的最佳條件為：壓力控制在70MPa，破碎時(shí)間15min。以TJS環(huán)氧基樹脂作為固定載體，最適固定化條件為：TJS用量1g對(duì)應(yīng)133u酶活，固定時(shí)間15h，溫度28℃，pH值7.5最后固定化酶活為58u·g-1，蛋白固定率可達(dá)98％，酶活回收率達(dá)到49.3