羧甲司坦單用或聯(lián)合布地奈德對COPD氣道炎癥和氧化應激水平的影響.pdf

1、目的：
　　慢性阻塞性肺疾病(COPD)是全球范圍內的主要致死病因之一，嚴重危害人類健康。如何有效地治療COPD，特別是減少COPD急性發(fā)作的頻次，對于肺功能的保護和患者預后都有重要的意義。
　　羧甲司坦(S-CMC)是一種臨床常用的黏液調節(jié)劑。已有大量的基礎和臨床研究證實，羧甲司坦的抗炎、抗氧化作用比其本身的祛痰作用更為顯著。一項由鐘南山院士和康健教授牽頭的隨機雙盲對照研究(PEACE Study)顯示，長期規(guī)律口服羧甲司

2、坦能夠預防慢阻肺的急性加重。但國外一些研究與之尚存在分歧。分析其異同發(fā)現(xiàn)，基礎應用糖皮質激素可能對羧甲司坦的抗炎、抗氧化作用存在影響。
　　目前國內外雖然有較多關于黏液調節(jié)劑治療COPD的基礎和臨床研究，但研究者的興趣點均在于此類藥物是否有效，而忽視了在何種狀態(tài)下有效。本研究旨在通過比較羧甲司坦單用或聯(lián)合吸入性糖皮質激素的療效證實羧甲司坦能夠改善COPD氣道炎癥和氧化應激水平，并探討吸入糖皮質激素對羧甲司坦上述作用的影響機制，為羧

3、甲司坦在COPD治療中的應用提供重要的理論依據(jù)。
　　材料和方法：
　　一、體內實驗:羧甲司坦對慢性阻塞性肺疾病大鼠氣道炎癥和氧化應激水平的影響
　　1、COPD大鼠模型的制備
　　SPF級雄性Wistar大鼠隨機分為5組:對照組（N組）、熏煙組(CN組)、羧甲司坦組（CC組）、布地奈德組（CB組）、聯(lián)合組（CCB組），每組10只。對照組（N組）:正常飼養(yǎng);其余4組慢性熏煙刺激12周，采用自制吸煙染毒箱（玻璃制成

4、，體積0.8×0.6×0.6m3，箱頂留有2個2×2cm2通氣孔），燃燒紅金龍牌香煙，由三通管導入煙霧，一次熏煙12支，煙霧濃度約5％，0.5h/次，2次/天，5天/周。造模成功后分別加干預因素（CN組每日霧化生理鹽水30ml; CB組每日霧化布地奈德1mg/kg; CC組每日給予羧甲司坦500mg/kg灌胃;CCB組同時給予以上兩種藥物）4周后進行實驗。
　　2、肺功能測定
　　水合氯醛腹腔注射麻醉，采用Medlab醫(yī)學軟

5、件分析系統(tǒng)測定各組大鼠PEF、FEV0.3/FVC％。
　　3、留取血清、BALF、肺組織標本
　　水合氯醛腹腔注射麻醉大鼠，眼球取血，離心后收集血清保存待檢。行氣管插管，以生理鹽水反復灌洗左肺收集BALF，留做細胞分類計數(shù)。將左肺組織固定于4％多聚甲醛中，制作石蠟切片用于組織病理和免疫組織化學檢測。右肺組織置-80℃保存用于Western-blot和Real-time PCR檢測。
　　4、石蠟切片HE染色
　

6、　制作大鼠肺組織石蠟切片并行HE染色評價病理形態(tài)學改變，應用顯微圖像分析系統(tǒng)定量分析肺平均內襯間隔(MLI)、平均肺泡數(shù)(MAN)。
　　5、免疫組織化學染色
　　免疫組織化學染色比較各組大鼠肺組織TNF-α、NF-κB、IκBα的表達。
　　6、酶聯(lián)免疫吸附實驗(ELISA)
　　檢測大鼠血清及肺組織勻漿的TNF-α、IL-8、IL-6水平。
　　7、氧化應激
　　檢測大鼠血清SOD、MDA水平。<

7、br>　　8、蛋白印跡實驗(Westem-Blot)
　　檢測大鼠肺組織NF-κB、ERK1/2蛋白的表達。
　　9、實時熒光定量逆轉錄聚合酶鏈法(Real-time PCR)
　　檢測大鼠肺組織NF-κB、ERK1/2 mRNA表達。
　　二、體外實驗:羧甲司坦對人氣道上皮細胞炎癥及氧化應激水平的影響及其調控機制
　　1、人氣道上皮細胞株(16HBE細胞)培養(yǎng)
　　2、煙霧提取物(CSE)的制備:制

8、備的CSE濃度設定為100％，稀釋不同濃度的CSE30min內用于實驗。
　　3、MTT法檢測不同濃度CSE對細胞生存率的影響:分別加入不同濃度(80％、40％、20％、10％、5％、2.5％、1.25％、0.63％、0％) CSE于干預后1h、3h、6h、12h、24h、48h處理細胞。
　　4、分7組給予藥物干預:(1)對照組（N組）;(2)模型組（CN組）:CSE;(3)羧甲司坦組（CC組）: CSE+羧甲司坦;(4)

9、布地奈德組（CB組）:CSE+布地奈德;(5)聯(lián)合組（CCB組）:CSE+布地奈德+羧甲司坦;(6)抑制劑組（CNP組）: CSE+ PD98059;(7)激動劑組（CCE組）:CSE+羧甲司坦+EGF。
　　5、ELISA法檢測炎癥因子IL-8、IL-6水平的變化。
　　6、氧化應激水平檢測:Fe3+還原法測定血漿總抗氧化能力(T-AOC)，DTNB法測定谷胱甘肽(GSH)含量。
　　7、Western-Blot方法

10、檢測ERK、P-ERK、IκBα、P-IκBα蛋白水平的變化。
　　8、Real-time PCR方法檢測ERK1/2、NF-κBmRNA水平的變化。
　　結果：
　　一、體內實驗部分
　　1、病理及肺功能改變
　　組織病理學提示CN組肺泡腔擴張，肺泡壁斷裂，部分肺泡融合形成肺大皰，并伴有炎性細胞浸潤，MLI增加，MAN降低，肺功能檢測FEV0.3/FVC＜70％，符合COPD診斷，證明COPD大鼠模型造模

11、成功。CC組、CB組和CCB組病理及肺功能均較CN組有所改善。
　　2、TNF-α、NF-κB、IκBα免疫組化染色
　　與N組比較，CN組大鼠氣道上皮、肺泡間隔及巨噬細胞漿內TNF-α陽性表達增加，胞漿及胞核內NF-κB陽染增多，其余三組較CN組減輕。IκBα免疫組化染色與NF-κB結果相反。
　　3、BALF細胞分類計數(shù)
　　與N組相比，CN組大鼠BALF細胞總數(shù)、中性粒細胞百分比明顯升高，巨噬細胞百分比明顯

12、降低，差異有顯著統(tǒng)計學意義;CC組BALF細胞總數(shù)及中性粒細胞百分比較CN組有所降低。
　　4、炎癥因子和氧化應激水平
　　與N組相比，CN組TNF-α、IL-8、IL-6、MDA水平明顯升高，SOD水平降低，CC組、CB組及CCB組較CN組改善，給藥三組間無統(tǒng)計學差異。
　　5、NF-κB、ERK1/2蛋白和mRNA的表達
　　與N組相比，CN組NF-κB、ERK1/2蛋白和mRNA的表達明顯增高，CC組、CB

13、組及CCB組較CN組降低，給藥三組間無統(tǒng)計學差異。
　　二、體外實驗部分
　　1、隨著CSE濃度的升高，HBE細胞的生存率呈下降趨勢。CSE濃度在10％-80％之間，隨著作用時間延長，細胞生存率明顯降低。
　　2、CN組IL-8、IL-6水平均較N組明顯升高，CC組、CB組及CCB組上述指標較CN組有所降低，但此三組間無統(tǒng)計學差異。
　　3、CN組GSH、T-AOC水平均較對照組明顯降低，CC組、CB組及CCB組

14、上述指標均較CN組有所升高。
　　4、與N組相比，CN組P-ERK、P-Iκ Bα蛋白表達明顯增高;CC組、CB及CCB組上述指標較CN組明顯降低。給予PD98059干預后P-ERK明顯降低，給予EGF干預后P-ERK較CC組有所回升。
　　5、與N組比較，CN組細胞ERK、NF-κBmRNA表達均明顯增高;CC組、CB組及CCB組上述指標較CN組均明顯降低。
　　結論：
　　1、被動熏煙12周成功復制出COPD