EDAG對人原代CD34+細胞增殖分化特性影響的研究.pdf

1、紅系分化相關(guān)基因(Erythroid Differentiation Associated Gene,EDAG)是利用代表性差異顯示技術(shù),自人胎肝中克隆分離出的新基因。EDAG特異表達于不同發(fā)育時期的造血組織,高表達于造血干/祖細胞以及紅系前體細胞,在成熟血液細胞中不表達。EDAG促進造血細胞的增殖、抑制凋亡,并參與調(diào)節(jié)細胞分化,對造血干細胞的譜系分化平衡起重要作用。EDAG與紅系分化重要的轉(zhuǎn)錄因子GATA1存在正反饋調(diào)控機制,能上調(diào)G

2、ATA1表達,促進GATA1下游紅系相關(guān)靶基因的轉(zhuǎn)錄,進而使細胞出現(xiàn)紅系表型。但前期研究主要集中在體外細胞系以及轉(zhuǎn)基因小鼠模型中,EDAG對人原代造血干細胞(Hematopoietic Stem Cell,HSC)的增殖、分化以及造血重建能力的影響尚未明確。本論文以富含造血干/祖細胞的健康產(chǎn)婦臍帶血CD34+細胞為研究對象,研究EDAG對造血干細胞增殖、分化及存活能力的影響。
　　第一,EDAG促進CD34+細胞在體外向紅系分化。

3、首先檢測EDAG在骨髓造血干/祖細胞不同亞群中的表達情況,發(fā)現(xiàn)與造血干細胞(HSC)相比,EDAG在髓系祖細胞(CMP)、紅系-巨核系祖細胞(MEP)中高度富集,而在淋巴系祖細胞(CLP)中則表達極低;進一步檢測EDAG在紅系分化過程中的表達變化情況,發(fā)現(xiàn)在CD34+細胞經(jīng)半固體培養(yǎng)基培養(yǎng)而得的BFU-E、CFU-E中以及CD34+細胞在液體培養(yǎng)基誘導紅系分化過程中,EDAG表達均顯著上調(diào),提示EDAG在HSC紅系分化過程發(fā)揮調(diào)控作用。

4、為進一步檢測EDAG在紅系分化中的作用,構(gòu)建了過表達EDAG的慢病毒載體以及針對EDAG的RNAi慢病毒載體,并分別包裝成慢病毒顆粒;經(jīng)檢測,慢病毒對人原代臍血CD34+細胞具有較高的感染效率(40％以上)。過表達EDAG可促進CD34+細胞在液體培養(yǎng)基中向紅系分化,表現(xiàn)為CD71+GPA+雙陽性細胞,特別是CD71+GPAint細胞比例增高,聯(lián)苯胺染色陽性細胞增多。在半固體培養(yǎng)體系下,過表達EDAG的CD34+細胞形成總集落(CFC)

5、數(shù)量增多,其中紅系集落BFU-E比例增高;收取細胞進行二次接種,BFU-E比例進一步增高。同時,在過表達EDAG的細胞集落中,GATA1及其下游紅系相關(guān)靶基因表達上調(diào)。另一方面,敲低EDAG降低CD71+GPA+細胞以及聯(lián)苯胺染色陽性細胞比例;在半固體培養(yǎng)條件下,敲低EDAG后CD34+細胞集落形成能力降低,BFU-E比例下降。敲低EDAG后GATA1及其下游紅系相關(guān)靶基因表達下調(diào)。進一步對EDAG促進紅系分化的機制進行研究,發(fā)現(xiàn)缺失與

6、GATA1相互作用的N端或缺失與p300相互作用的C端,EDAG均喪失促進紅系分化的活性,表明EDAG促進紅系分化依賴于EDAG/GATA1/p300復合體的形成。同時,在紅系誘導過程中加入p300乙酰轉(zhuǎn)移酶活性特異抑制劑C646,流式分析及聯(lián)苯胺染色實驗均表明EDAG促進紅系分化的功能喪失,表明p300酶活性在EDAG發(fā)揮促紅系分化功能中起關(guān)鍵作用。同時發(fā)現(xiàn)在紅系分化過程中,過表達EDAG促進CD34+細胞增殖,并抑制由于撤除EPO誘

7、導的細胞凋亡;敲低EDAG后CD34+細胞增殖減緩,撤除EPO后細胞凋亡增加。進一步利用基因芯片分析在CD34+細胞向紅系分化過程中,敲低EDAG后基因表達譜變化,并與GATA1的靶基因進行比對。發(fā)現(xiàn)EDAG正調(diào)控GATA1轉(zhuǎn)錄激活的紅系靶基因,而對GATA1轉(zhuǎn)錄抑制的靶基因沒有影響或存在正調(diào)控作用,提示EDAG對GATA1的靶基因存在選擇性調(diào)控機制;進一步分析發(fā)現(xiàn)EDAG還調(diào)控了大量并不被GATA1調(diào)控的基因群,提示EDAG對紅系分化

8、的調(diào)控可能還存在新的未知機制。
　　第二,利用HSC移植模型證實在體內(nèi)EDAG促進CD34+細胞向紅系發(fā)育。首先在受體小鼠品系、照射條件以及用于移植的細胞處理三個方面對造血干細胞移植模型的建立進行條件優(yōu)化。最終確定,利用NOD/SCID/IL2γnull小鼠作為受體;移植前接受兩次、共2.5Gy劑量的X射線照射;利用新鮮分離的臍血CD34+細胞,不經(jīng)過凍融,并在分離后72小時內(nèi)完成2次慢病毒感染以及移植,能達到較高的嵌合率,并能檢

9、測到向紅系發(fā)育的細胞。利用構(gòu)建的造血干細胞移植模型,在臍血CD34+細胞過表達EDAG后經(jīng)尾靜脈注射移植入受照受體小鼠,并在移植后第4周檢測細胞發(fā)育情況。結(jié)果顯示與對照組相比過表達EDAG后CD71+GPA+細胞比例增高,表明過表達EDAG促進細胞向紅系發(fā)育,與體外實驗結(jié)果一致。同時發(fā)現(xiàn)過表達EDAG后CD34+細胞比例及CD11b+細胞比例均有所增高,提示EDAG可能還參與了HSC的自我更新及定向分化的調(diào)節(jié)。
　　第三,體外擴增

10、培養(yǎng)過程中EDAG促進CD34+細胞增殖、抑制凋亡,并且維持細胞處于細胞周期。在擴增培養(yǎng)條件下,過表達EDAG提高CD11b+比例,對其他譜系表面標志無明顯影響,表明在體外過表達EDAG促進細胞向髓系分化。同時發(fā)現(xiàn)過表達EDAG后CD34+細胞比例下降緩慢,提示過表達EDAG有助于造血干細胞特性的維持,這與體內(nèi)結(jié)果一致。進一步研究發(fā)現(xiàn)過表達EDAG促進CD34+細胞增殖,并抑制撤除細胞因子誘導的細胞凋亡;相應地,敲低EDAG后CD34+

11、細胞增殖緩慢,撤除細胞因子后凋亡增加。同時發(fā)現(xiàn)過表達EDAG維持CD34+細胞處于細胞周期:過表達EDAG后處于G0期細胞減少,進入細胞周期(G1/S/G2/M)的細胞增多。相應地,敲低EDAG則使G0期細胞比例增加,進入細胞周期的細胞減少。這些結(jié)果表明EDAG促進CD34+細胞增殖,提高細胞存活能力,并調(diào)控細胞周期進程。
　　綜上,本研究利用體外、體內(nèi)模型證實EDAG是一種新的紅系分化正調(diào)控因子,可通過與GATA1/p300形成