CD34+細(xì)胞在不同條件下向內(nèi)皮細(xì)胞分化的體外研究.pdf

1、目的：建立人臍血CD34+細(xì)胞分離、培養(yǎng)的方法,研究其在內(nèi)皮細(xì)胞誘導(dǎo)因子作用下向內(nèi)皮細(xì)胞分化的特性；初步探討CD34+細(xì)胞在臍帶間充質(zhì)干細(xì)胞旁分泌下向內(nèi)皮細(xì)胞誘導(dǎo)分化的可行性；建立人臍靜脈內(nèi)皮細(xì)胞體外分離、培養(yǎng)、鑒定的高效方法。
　　 方法：收集健康產(chǎn)婦剖宮產(chǎn)后的臍血、臍帶(產(chǎn)婦知情同意)。臍血中加入6.0％HES,收集上層富含有核細(xì)胞的血漿,加至淋巴細(xì)胞分離液的液面上,制備單個(gè)核細(xì)胞懸液,按MACS試劑盒說明書分選出CD34+

2、細(xì)胞。取臍帶剪碎后用Ⅳ型膠原酶、胰酶消化獲得細(xì)胞接種于培養(yǎng)瓶中,貼壁細(xì)胞接近融合時(shí)傳代并獲得MSC,取第3代實(shí)驗(yàn)。取臍靜脈一端夾閉,另一端灌注胰酶。10 min后PBS沖洗臍靜脈,收集內(nèi)皮細(xì)胞接種于培養(yǎng)瓶中,37℃培養(yǎng)。傳1～3代,備用。EPICSALTRA流式細(xì)胞儀鑒定以上細(xì)胞表面標(biāo)志。按不同實(shí)驗(yàn)條件分組:CD34+細(xì)胞單純培養(yǎng)組,分離CD34+細(xì)胞以1～3×105/cm2接種于12孔板中,每孔加入2mlM199培養(yǎng)液(20％FBS、

3、維生素C50ug/L、L-谷氨酰胺20mm/L),在飽合濕度、37℃、5％CO2溫箱里培養(yǎng),3～4d換液一次；CD34+細(xì)胞誘導(dǎo)分化組,將分離的CD34+細(xì)胞按1～3×105/cm2接種于人纖連蛋白包被的12孔板中,每孔中加入2mlM199培養(yǎng)液(20％FBS、VEGF50ng/ml、b-FGF1ng/ml、IGF-12ng/ml、維生素C50ug/I_、L-谷氨酰胺20mm/L),培養(yǎng)條件同上。CD34+細(xì)胞與UC-MSC分隔共培養(yǎng)組

4、,以5ug/cm2人纖維連接蛋白鋪6孔板底,將分離CD34+細(xì)胞以1～3×105/cm2接種于板中。8～9×105UC-MSC接種于1.5％明膠包被的Transwell小室,后將小室懸置在有CD34+細(xì)胞的6孔板中。加入M199培養(yǎng)液(20％FBS、維生素C50ug/L、L-谷氨酰胺20mm/L),在飽合濕度、37℃、5％CO2溫箱里培養(yǎng),3～4d換液一次。
　　 結(jié)果：實(shí)驗(yàn)處理20份新鮮臍血標(biāo)本,采集體積為(103.80±19

5、.77)ml(80～150ml)。MACS分選每份臍血獲得CD34+細(xì)胞為(10.98±5.88)×105,流式細(xì)胞檢測(cè)CD34+細(xì)胞純度為(95.02±3.81)％。分選CD34+細(xì)胞呈小圓形懸浮于培養(yǎng)液中。CD34+細(xì)胞誘導(dǎo)分化后,培養(yǎng)3d有明顯集落形成及部分細(xì)胞貼壁,14d貼壁細(xì)胞呈條索狀,逐漸增多后呈鋪路石樣改變。CD34+細(xì)胞與UC-MSC分隔共培養(yǎng)后,48 h后開始貼壁,7～8d貼壁完全,貼壁細(xì)胞呈條索狀或長(zhǎng)條形,20d后細(xì)

6、胞逐漸增多形成集落團(tuán)。酶消化法獲得UC-MSC,培養(yǎng)24 h后細(xì)胞開始貼壁；7 d細(xì)胞基本長(zhǎng)滿瓶底,細(xì)胞形態(tài)為長(zhǎng)梭形或不規(guī)則形,類似于成纖維細(xì)胞狀；10 d后細(xì)胞接近融合,呈漩渦樣生長(zhǎng)。流式檢測(cè)UC-MSC(4代)示:CD10597.4％、CD2971.1％、CD4980.0％、CD341.6％。消化分離的臍靜脈內(nèi)皮細(xì)胞呈小圓形且聚集成團(tuán)；2 h細(xì)胞開始貼壁,呈條索狀:7d細(xì)胞增多呈漩渦樣生長(zhǎng)；此后細(xì)胞繼續(xù)增多接近融合,亦呈鋪路石樣改變

7、。流式檢測(cè)臍靜脈內(nèi)皮細(xì)胞高表達(dá)血管內(nèi)皮細(xì)胞特異性標(biāo)志CD144、vWF、CD31,部分表達(dá)CD34,而白細(xì)胞共同抗原CD45為陰性表達(dá)。CD34+細(xì)胞培養(yǎng)14d后,流式檢測(cè)單純培養(yǎng)CD34+細(xì)胞表達(dá)CD31、CD144、vWF、CD34、CD45分別為(30.44±2.67)％、(26.19±1.98)％、(11.46±2.04)％、(51.96±5.80)％、(38.3±4.57)％；誘導(dǎo)分化組CD31、CD144、vWF分別為(78

8、.38±7.20)％、(69.16±1.99)％、(57.49±3.67)％(與單純培養(yǎng)組比P<0.05),CD34(13.99±4.50)％,白細(xì)胞共同抗原CD45為陰性表達(dá)。而CD34+細(xì)胞與MSC共培養(yǎng)組表達(dá)CD31、CD144、VWF分別為(65.43±5.61)％、(54.40±4.13)％、(47.53±3.96)％(與單純培養(yǎng)組比P<0.05),部分表達(dá)CD34,陰性表達(dá)CD45,這與誘導(dǎo)分化組及成熟的臍靜脈內(nèi)皮細(xì)胞表達(dá)率

9、相一致。
　　 結(jié)論臍血中存在CD34+細(xì)胞,利用MACS可高效、快速、無損傷的獲得高純度CD34+細(xì)胞,在外源性細(xì)胞因子條件下CD34+細(xì)胞可向內(nèi)皮細(xì)胞分化。經(jīng)酶消化法可從臍帶中獲得UC-MSCs,易于獲得,體外增殖能力強(qiáng),與骨銹來源間充質(zhì)干細(xì)胞的免疫表型相一致,符合UC-MSCs基本的生物學(xué)特性。實(shí)驗(yàn)中發(fā)現(xiàn)UC-MSCs旁分泌作用與外源性細(xì)胞因子都具有促分化作用,都能使臍血CD34+細(xì)胞向內(nèi)皮細(xì)胞分化,因此在促內(nèi)皮細(xì)胞分化過