rhIL-15在臍血源CD34+造血干細(xì)胞向NK細(xì)胞分化中的作用.pdf

1、目的:
　　 1.在體外建立臍血CD34+細(xì)胞向自然殺傷細(xì)胞(natural killer cell，NK細(xì)胞)誘導(dǎo)分化體系，并研究不同的細(xì)胞因子組合對(duì)NK細(xì)胞表型、分化機(jī)制、增殖、殺傷活性的影響。
　　 2.探討rhIL-15在CD34+細(xì)胞向NK細(xì)胞誘導(dǎo)分化過(guò)程中的作用及相關(guān)機(jī)制。
　　 方法:
　　 1.純化臍血來(lái)源的CD34+細(xì)胞取臍靜脈血稀釋后，用淋巴細(xì)胞分離液密度梯度離心法收集臍血單個(gè)核細(xì)胞(

2、cord blood-mononuclear cell，CB-MNC)。利用MACS富集CB-MNC內(nèi)的CD34+細(xì)胞備用，流式細(xì)胞儀檢測(cè)其純度。
　　 2.建立CD34+細(xì)胞向NK細(xì)胞誘導(dǎo)分化體系將純化的臍血來(lái)源CD34+細(xì)胞以1×105/ml的起始密度接種于24孔板，每孔加入1ml完全RPMI1640培養(yǎng)基（含10％熱滅活的胎牛血清，10-6mol/LHDC）。根據(jù)加入細(xì)胞因子的不同，實(shí)驗(yàn)分為3組:A組(SCF+FLT-3L

3、+IL-2+IL-7+IL-15)、B組(SCF+FLT-3L+IL-2+IL-7)、C組(SCF+FLT-3L+IL-7)。C組細(xì)胞培養(yǎng)3周后分為C1、C2、C3三組，相應(yīng)加入IL-2、IL-15、IL-2+IL-15繼續(xù)誘導(dǎo)分化2周，每組設(shè)3個(gè)復(fù)孔。所用細(xì)胞因子濃度為SCF20ng/ml、FLT-3L10ng/ml、IL-2500U/ml、IL-720ng/ml、IL-1510ng/ml。置于37℃、5％CO2、飽和濕度培養(yǎng)箱中培養(yǎng)

4、5周，每3-4天半量換液，全量補(bǔ)充細(xì)胞因子。
　　 3.細(xì)胞增殖和免疫表型分析每周以細(xì)胞計(jì)數(shù)法檢測(cè)細(xì)胞增殖，流式細(xì)胞儀分析細(xì)胞免疫表型。檢測(cè)指標(biāo)如下:A、B兩組中CD3-CD56+NK細(xì)胞的比例;C組中CD34brightCD122+NK祖細(xì)胞的比例;C1、C2、C3組中NK細(xì)胞的比例。
　　 4.CCK-8法檢測(cè)NK細(xì)胞殺傷活性檢測(cè)對(duì)象為:誘導(dǎo)分化5周的A、B組NK細(xì)胞和臍血活化的NK細(xì)胞?；罨腘K細(xì)胞由臍血單個(gè)核細(xì)

5、胞經(jīng)IL-2500U/ml和IL-1510ng/ml刺激2周獲得，用來(lái)與誘導(dǎo)分化NK細(xì)胞的殺傷活性相比較。所用靶細(xì)胞為Hela細(xì)胞和K562細(xì)胞。
　　 5.real-timePCR法檢測(cè)相關(guān)基因的表達(dá)A、B組誘導(dǎo)分化的NK細(xì)胞和CD34+細(xì)胞檢測(cè)腫瘤壞死因子、顆粒酶B、穿孔素、干擾素-γbcl-2、bax、STAT5A、STAT5B的表達(dá)水平。
　　 結(jié)果:
　　 1.分選前CB-MNC中CD34+細(xì)胞僅占2.

6、46％，經(jīng)過(guò)MACS分選后CD34+細(xì)胞比例到達(dá)88.7％。每份臍血可獲得(3-6)×105個(gè)CD34+細(xì)胞。
　　 2.根據(jù)流式細(xì)胞儀檢測(cè)結(jié)果，A、B兩組細(xì)胞誘導(dǎo)培養(yǎng)5周后，NK細(xì)胞比例分別為61.59％、17.91％;平均每個(gè)CD34+細(xì)胞可誘導(dǎo)獲得的NK細(xì)胞數(shù)分別為122個(gè)及21個(gè);共表達(dá)NKG2D受體的CD56+NK細(xì)胞比例分別為73.4％、57.5％。以上數(shù)據(jù)說(shuō)明IL-15可以提高NK細(xì)胞的誘導(dǎo)分化效率和擴(kuò)增倍數(shù)，促進(jìn)

7、NK細(xì)胞表達(dá)NKG2D受體。C組細(xì)胞誘導(dǎo)培養(yǎng)3周后，NK祖細(xì)胞比例達(dá)到23.1％，分別以IL-2、IL-15、IL-2+IL-15繼續(xù)刺激2周后，C1、C2、C3組中NK細(xì)胞比例分別為7.45％、14.14％、16.83％，說(shuō)明SCF+FLT-3L+IL-7的組合能夠誘導(dǎo)產(chǎn)生NK祖細(xì)胞，IL-15能夠促進(jìn)其分化發(fā)育為成熟NK細(xì)胞。
　　 3.殺傷實(shí)驗(yàn)中，各組細(xì)胞在效靶比為10∶1時(shí)殺傷效果最強(qiáng)。A組對(duì)K562細(xì)胞和Hela細(xì)胞的

8、殺傷率為24.7％和19.5％;B組對(duì)K562細(xì)胞和Hela細(xì)胞的殺傷率最低，分別為10.7％和8.5％。提示IL-15能夠提高NK細(xì)胞的殺傷活性。
　　 4.RealtimePCR結(jié)果顯示，A、B組NK細(xì)胞中腫瘤壞死因子、顆粒酶B、穿孔素、干擾素-γ表達(dá)水平較CD34+細(xì)胞明顯提高，且A組基因表達(dá)水平比B組高。說(shuō)明誘導(dǎo)分化的NK細(xì)胞具有分泌細(xì)胞因子的能力，IL-15能夠促進(jìn)NK細(xì)胞分泌細(xì)胞因子。A組bcl-2、STAT5A、S

9、TAT5B、bcl-2/bax=2.356表達(dá)水平較B組升高。提示IL-15可能通過(guò)JAK3-STAT5通路介導(dǎo)CD34+細(xì)胞向NK細(xì)胞分化，通過(guò)上調(diào)bcl-2表達(dá)抑制細(xì)胞凋亡。
　　 結(jié)論:
　　 1.臍血源CD34+細(xì)胞可以在體外誘導(dǎo)分化為NK細(xì)胞，最佳細(xì)胞因子組合為SCF+FLT-3L+IL-2+IL-7+IL-15。
　　 2.誘導(dǎo)分化產(chǎn)生的NK細(xì)胞主要為CD56bright亞群，具有分泌細(xì)胞因子和殺傷腫