新型雜環(huán)類乙肝病毒抑制劑的設(shè)計(jì)、合成及其活性研究.pdf

1、乙肝是由乙型肝炎病毒(HBV)所致的重大傳染性疾病，長期發(fā)展可導(dǎo)致急慢性病毒性肝炎、肝硬化（liver cirrhosis,LC）、肝代謝失常和肝癌(hepatocellular carcinoma，HCC)等疾病。據(jù)世界衛(wèi)生組織(WHO)報道，全球大約有2.4億人為慢性HBV感染者，每年約有68.6萬人死于HBV感染所致的急、慢性肝炎及相關(guān)并發(fā)癥。我國約有9000萬HBV攜帶者，平均每年約28萬人因感染乙肝病毒而死亡，嚴(yán)重影響我國人民

2、身體健康和社會發(fā)展，研究有效防治HBV的藥物已成為我國藥物研發(fā)的當(dāng)務(wù)之急。
　　HBV屬嗜肝DNA病毒科(hepadnaviridae)，基因組為部分雙鏈環(huán)狀DNA，其復(fù)制過程主要包括:靶細(xì)胞的吸附、融合、脫殼、DNA的修補(bǔ)、轉(zhuǎn)錄、翻譯、逆轉(zhuǎn)錄和DNA的復(fù)制、病毒顆粒的組裝和出芽等過程?；趯BV生命周期的認(rèn)識和分子生物學(xué)的研究，目前用于預(yù)防和治療慢性乙型肝炎(CHB)的藥物主要有疫苗、干擾素、免疫調(diào)節(jié)藥以及DNA聚合酶抑制劑。

3、其中HBV疫苗只能預(yù)防而不能治療HBV的感染;α干擾素(IFN-α)雖然具有免疫調(diào)節(jié)和抗病毒的雙重作用，但其只對30％～40％的患者有效，且不良反應(yīng)多，限制了它的臨床應(yīng)用;α1-胸腺肽(thymosin-α1，Tα1)等免疫調(diào)節(jié)藥可以提高人體對HBV的特異性免疫，但是缺乏針對性，一般作為輔助用藥或與其他HBV藥物聯(lián)合治療;靶向于HBV DNA聚合酶的核苷（酸）類抑制劑，因其對HBV顯著的抑制作用以及臨床上良好的耐受性而被廣泛應(yīng)用。然而，

4、由于HBV基因組的遺傳異質(zhì)性，病毒極易對該類藥物產(chǎn)生耐藥性，且不能夠根治。因此，研究開發(fā)高效、低毒和抗耐藥的新型HBV抑制劑依然是當(dāng)前抗乙肝藥物研發(fā)的熱點(diǎn)。
　　核心蛋白是HBV核殼體組成的主要結(jié)構(gòu)蛋白，在病毒進(jìn)化過程中相對保守，并且核心蛋白的組裝在乙肝病毒生命周期中發(fā)揮著重要的作用。本論文第二章以核衣殼蛋白裝配抑制劑AT-130及臨床藥物異噻氟啶(NZ-4)為先導(dǎo)化合物，基于骨架躍遷、電子等排和藥效團(tuán)雜合的原理設(shè)計(jì)合成了吡唑類、

5、噻唑類、吡嗪類、嘧啶類和吡啶類共8個小系列的雜環(huán)化合物。其中，SeriesⅠ系列將噻唑環(huán)通過電子等排替換為吡唑環(huán)，同時在1位選擇優(yōu)勢基團(tuán)噻唑環(huán)，重點(diǎn)探討了4位取代基對抗病毒活性的影響;SeriesⅡ系列將噻唑環(huán)通過電子等排替換為吡唑環(huán)，同時探討1位取代對抗病毒活性的影響，另外，討論將1位噻唑環(huán)替換為3-氟苯環(huán)后對活性的影響;SeriesⅢ系列將噻唑環(huán)通過電子等排替換為吡唑環(huán)，并重點(diǎn)探討3位取代基對抗病毒活性的影響;SeriesⅣ系列依然

6、采用并二噻唑優(yōu)勢骨架，對4位進(jìn)行修飾，以期得到高效低毒的先導(dǎo)化合物;SeriesⅤ-Ⅶ系列將噻唑環(huán)分別換成吡嗪、嘧啶和吡啶等六元環(huán)，增加結(jié)構(gòu)的多樣性，同時初步探討六元環(huán)骨架對活性的影響，為進(jìn)一步優(yōu)化奠定基礎(chǔ);SeriesⅧ系列仍然采用噻唑環(huán)，但是取代基的位置發(fā)生了變化，對2位和5位取代基進(jìn)行了多樣性修飾，探討將氫鍵受體N和S置換后對活性的影響。
　　體外細(xì)胞活性篩選結(jié)果顯示，噻唑環(huán)骨架優(yōu)于吡唑類，優(yōu)于嘧啶、吡嗪和吡啶骨架;化合物Ⅳ

7、-8c表現(xiàn)了最好的抑制HBVDNA復(fù)制活性，其IC50為2.2±1.1μM，優(yōu)于先導(dǎo)化合物Ⅳ-8a(NZ-4，2.3±0.5μM);化合物Ⅰ-8g抑制HBV DNA復(fù)制活性的IC50為3.8±0.3μM，與先導(dǎo)化合物活性相當(dāng)，但是其抑制HBVDNA復(fù)制的選擇性系數(shù)大于26.3，優(yōu)于先導(dǎo)化合物的選擇性系數(shù)(SI=25.7)，可以作為先導(dǎo)化合物進(jìn)一步修飾。
　　表面等離子共振實(shí)驗(yàn)驗(yàn)證了該類化合物的作用靶點(diǎn)為HBV核心蛋白，且化合物Ⅰ-

8、8g和Ⅳ-8c與核心蛋白的親和力常數(shù)分別為60.8μM和60.0μM，與先導(dǎo)化合物NZ-4(KD=50.6μM)相當(dāng)，其結(jié)果與細(xì)胞活性基本一致，可以作為先導(dǎo)化合物供進(jìn)一步研究。
　　本論文第三章基于文獻(xiàn)報道的二氫嘧啶類HBV抑制劑的構(gòu)效關(guān)系、CoMFA和CoMSIA的等勢圖以及核心蛋白與配體的晶體復(fù)合物結(jié)構(gòu)，設(shè)計(jì)合成了一類新穎的二氫嘧啶-三氮唑化合物。其中，將嗎啉環(huán)替換為三氮唑基團(tuán)提高其代謝穩(wěn)定性;通過連接一些親水基團(tuán)與周圍氨基酸

9、殘基Ser121形成氫鍵，較大的疏水基團(tuán)可與氨基酸殘基Pro138形成疏水作用力，增強(qiáng)其抗病毒活性;R基團(tuán)為2-氨基苯目標(biāo)化合物與先導(dǎo)化合物GLS4能夠較好的疊合;2'-氟-4'-溴取代的苯環(huán)位于Pro25、Asp29、Leu30、Thr33、Trp102、Ile105和Ser106殘基形成的疏水口袋，溴原子朝向蛋白且伸入疏水口袋內(nèi)，氟原子與相鄰蛋白的Val124殘基作用;噻唑基團(tuán)位于Trp102、Phe23、Phe122和Tyr118

10、殘基形成的疏水口袋，氮原子與Leu140通過水橋形成氫鍵作用;酯基位于氨基酸殘基Thr109、Phe110、Thr33和Leu37形成的腔穴頂端。
　　活性結(jié)果表明，微小的取代基的改變可能會造成活性的顯著變化，甚至消失;R基團(tuán)中，鄰位為極性基團(tuán)有利于抑制HBV DNA復(fù)制活性;但是，R基團(tuán)指向溶劑開口區(qū)，取代基的大小對活性影響很大，較大體積的酰胺和磺酰胺取代基導(dǎo)致活性的喪失。篩選的多個化合物都具有較好的抗病毒活性，其中，化合物Ⅹ-

11、5a的細(xì)胞毒性比先導(dǎo)化合物小，且其抑制HBV DNA復(fù)制的活性（IC50為0.35±0.04μM）優(yōu)于上市藥物拉米夫定（0.54±0.18μM）;另外，其抑制HBV DNA復(fù)制的選擇性系數(shù)(SI)優(yōu)于或相當(dāng)于先導(dǎo)化合物GLS4和上市藥物拉米夫定，可以作為先導(dǎo)化合物進(jìn)一步修飾。
　　本論文第四章以噻唑尼特和天然產(chǎn)物修飾得到的高活性2-吡啶酮類衍生物為先導(dǎo)化合物，基于藥效團(tuán)模型，通過電子等排和分子雜合原理設(shè)計(jì)合成了一系列新穎的3-芳基

12、-5-酰胺取代2-吡啶酮類化合物，以期提高其水溶性和抗病毒活性。其中，2-吡啶酮骨架中引入NH基團(tuán)提高其親水性;同時，將右翼的C-C鍵替換C-N鍵，在左翼引入酰胺基團(tuán)提高其抗病毒活性及其水溶性。
　　細(xì)胞水平的抗病毒活性結(jié)果顯示，多個化合物表現(xiàn)了較好的抑制HBV DNA復(fù)制活性，其中化合物Ⅻ-5u表現(xiàn)了最好的抑制HBV DNA復(fù)制活性，其IC50為4.5±2.3μM，與先導(dǎo)化合物Ⅺ-6活性相當(dāng)，稍弱于上市藥物拉米夫定，且具有一定的

13、抑制HBeAg分泌活性（IC50=9.8±2.8μM）。另外，通過HPLC方法測定了化合物Ⅻ-5u的水溶性，在純水和pH=7.4的PBS緩沖液中溶解度分別為13.26μg/mL和28.68μg/mL，提高了一定的水溶性，驗(yàn)證了實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)思想，可作為先導(dǎo)化合物進(jìn)一步修飾。
　　本論文第五章通過對核苷（酸）類似物與HBV逆轉(zhuǎn)錄酶作用機(jī)制、構(gòu)效關(guān)系以及抗耐藥性策略的充分理解和認(rèn)識，以上市藥物替比夫定為先導(dǎo)，構(gòu)建以新型苯并噻二嗪為堿基核苷酸

14、類的HBV逆轉(zhuǎn)錄酶抑制劑。其中，堿基部分采用苯并噻二嗪雜環(huán)，由于堿基的羰基被具有更強(qiáng)吸電子能力的砜基取代，可增強(qiáng)其鄰位NH在氫鍵形成中的供氫能力，同時本身作為氫鍵受體，可增強(qiáng)抑制劑與天然堿基之間氫鍵的結(jié)合能力，提高其在病毒DNA合成中的摻入率;核糖部分采用臨床藥物中活性較好的優(yōu)勢開環(huán)核糖，以提高其抗耐藥性并降低藥物毒副作用;同時對核糖部分以各種磷酸酯修飾，提高其抗病毒活性，并改善其藥動學(xué)性質(zhì)，提高生物利用度。細(xì)胞水平的抗病毒活性結(jié)果顯示

15、，在50μM濃度下，化合物ⅩⅣ-5、ⅩⅣ-7a和ⅩⅣ-7c表現(xiàn)了一定的抑制HBV DNA復(fù)制活性，其抑制率分別為68.3％、64.1％和57.6％，弱低于上市藥物拉米夫定(88.9％)。
　　創(chuàng)新性總結(jié):本論文基于骨架躍遷、電子等排、藥效團(tuán)雜合、前藥和靶點(diǎn)結(jié)構(gòu)的合理藥物設(shè)計(jì)等原理設(shè)計(jì)合成了吡唑類、噻唑類、吡嗪類、嘧啶類、吡啶類、吡啶酮類、苯并噻二嗪類和二氫嘧啶類等共8類HBV抑制劑，其中，吡唑環(huán)、吡嗪環(huán)、嘧啶環(huán)、吡啶環(huán)和苯并噻二嗪

16、環(huán)為全新骨架HBV抑制劑。
　　基于目標(biāo)化合物的結(jié)構(gòu)，通過文獻(xiàn)調(diào)研和逆向合成分析設(shè)計(jì)了合理可行的合成路線，共設(shè)計(jì)合成了14條合成路線，50個中間體和112個目標(biāo)化合物，其中，超過130個化合物未見文獻(xiàn)報道。
　　對所合成的108個目標(biāo)化合物進(jìn)行了活性研究。通過CCK-8法測定了化合物的細(xì)胞毒性，通過PCR法測定了化合物抑制HBV DNA復(fù)制活性，通過酶聯(lián)免疫法測定了目標(biāo)化合物對HBsAg和HBeAg抗原的分泌抑制活性，通過表

17、面等離子共振實(shí)驗(yàn)測定了目標(biāo)化合物與核心蛋白的親和力。其中，化合物Ⅳ-8c表現(xiàn)了較好的抑制HBV DNA復(fù)制活性，其IC50為2.2±1.1μM，優(yōu)于先導(dǎo)化合物Ⅳ-8a(NZ-4，2.3±0.5μM);化合物Ⅹ-5a的細(xì)胞毒性比先導(dǎo)化合物小，且其抑制HBV DNA復(fù)制的活性（IC50為0.35±0.04μM）優(yōu)于上市藥物拉米夫定（0.54±0.18μM）;化合物Ⅻ-5u抑制HBV DNA復(fù)制的IC50為4.5±2.3μM，與先導(dǎo)化合物活性