食源性棕櫚酸誘導斑馬魚肝臟脂毒性反應研究.pdf

1、棕櫚油，產(chǎn)量僅次于大豆油，已廣泛應用于魚類飼料中。棕桐油富含棕櫚酸，而細胞內過量的棕櫚酸積累會引起細胞功能紊亂或者細胞死亡，即脂毒性。在哺乳動物細胞模型中，高濃度棕櫚酸(250-500μM)會誘導內質網(wǎng)應激和凋亡，然而棕櫚酸脂毒性在暖水魚活體及細胞水平上還未見報道。
　　本研究的第一部分利用斑馬魚建立暖水魚的棕櫚酸養(yǎng)殖模型，向斑馬魚投喂低脂(LF)，高脂(HF)以及3種添加了棕櫚酸的高脂飼料(PA4％，PA8％，PA12％)，飼喂

2、2周檢測肝臟棕櫚酸積累情況，飼喂4周檢測血清ALT、血清AST、肝臟ALT、肝臟AST、肝臟caspase-3以及Trx和Saa2 mRNA水平，作為肝臟損傷指標;檢測Grp78和Chop mRNA水平，并且通過免疫組化檢測肝臟GRP78和CHOP蛋白水平，作為內質網(wǎng)應激指標。結果顯示，肝臟棕櫚酸含量隨飼料中含量的升高而升高;與HF組相比，PA8％和PA12％組血清ALT水平分別升高了40.7％和59.5％，血清AST水平分別升高了28

3、.8％和28.0％;與HF組相比，PA12％組Grp78和Chop mRNA分別增加至2.2和2.7倍，食源性棕櫚酸誘導斑馬魚肝臟損傷和內質網(wǎng)應激。
　　本研究第二部建立棕櫚酸-細胞模型，研究暖水魚肝臟對棕櫚酸脂毒性的反應機制。該部分利用RTCA實時監(jiān)控系統(tǒng)，Alarmablue活性檢測試劑檢測斑馬魚肝臟細胞活性，利用流式細胞儀檢測棕櫚酸對斑馬魚肝臟細胞凋亡的影響，利用qPCR檢測未折疊蛋白應答反應通路激活情況，并且用特異性抑制劑

4、阻斷通路激活，驗證該通路與棕櫚酸脂毒性的聯(lián)系。結果表明，與對照組相比，棕櫚酸抑制斑馬魚肝臟細胞活性，誘導斑馬魚肝臟細胞凋亡，且未折疊蛋白應答反應感應因子Grp78和Grp94 mRNA均受到棕櫚酸顯著性上調。阻斷PERK-CHOP和IRE1αt-JNK通路緩解棕櫚酸誘導的凋亡，阻斷ATF6通路加劇棕櫚酸誘導的凋亡。該部分結果表明，PERK-CHOP和IRE1α-JNK通路參與棕櫚酸對斑馬魚肝臟細胞的脂毒性。
　　本研究第三部分利用

5、斑馬魚幼魚驗證棕櫚酸對斑馬魚肝臟的脂毒性反應通路，向5-dpf幼魚投喂LF，HF，PA8％飼料，投喂1周，利用qPCR檢測內質網(wǎng)應激誘導情況及未折疊蛋白應答反應通路，并且根據(jù)檢測結果選擇特異性內質網(wǎng)應激抑制劑阻斷PERK-CHOP和ATF6通路。結果顯示，與HF組相比，PA8％組幼魚的Trx和Saa2均受到顯著性上調，Grp78、Grp94、Perk、ChopmRNA水平均較HF顯著升高，PA8％組幼魚自噬基因Bec1、Atg4b、At

6、g9a mRNA水平也受到上調;抑制劑試驗結果表明，與對照組(DMSO)相比，salubrinal有效抑制PA8％組幼魚PERK-CHOP通路基因表達，AEBSF有效抑制ATF6通路基因表達，salubrinal同時還下調了PA8％組幼魚自噬基因Bec1、Atg4b、Atg9a，肝臟損傷基因Saa2 mRNA水平。該部分結果表明，食源性棕櫚酸通過PERK-CHOP促凋亡通路誘導肝臟損傷。
　　通過研究食源性棕櫚酸對斑馬魚肝臟的負面