抗Siglec-9抗體Fab段抑制脂多糖誘導的炎性反應的體外研究.pdf

1、研究目的:Siglec-9屬于免疫球蛋白超家族的成員，歸屬于CD33相關的Siglec，通過識別含有唾液酸的糖鏈結構，在細胞增殖、活化以及凋亡和自噬方面發(fā)揮重要作用，同時參與調控機體的固有免疫和適應性免疫。Siglec-9主要表達于免疫細胞，如中性粒細胞和單核細胞，在淋巴細胞和樹突狀細胞上也可表達。膿毒癥是感染引起的全身炎癥反應綜合征，細菌內毒素刺激巨噬細胞產生大量的炎性因子，引起機體的抗炎因子和促炎因子失衡，嚴重時導致膿毒性休克和多器

2、官功能衰竭。本課題主要是通過基因工程技術，制備、表達抗Siglec-9Fab段，并對其進行生物特性鑒定，通過體外活性實驗進一步探討該抗體在炎癥方面發(fā)揮的作用。
　　研究方法:
　　1.制備抗Siglec-9抗體Fab利用前期篩選得到的陽性噬菌體，通過PCR技術擴增抗體輕鏈可變區(qū)（VL）和重鏈可變區(qū)（VH），經測序得到核酸和氨基酸序列并與數(shù)據(jù)庫比對。根據(jù)核酸序列設計引物，通過重疊延伸PCR技術將抗體輕鏈恒定區(qū)(CL)和重鏈恒定

3、區(qū)(CH1)分別與輕鏈可變區(qū)和重鏈可變區(qū)連接，獲得重組輕鏈（L）和重鏈（Fd）。經過限制性核酸內切酶酶切，L和Fd與表達載體pETDUET-1連接，構建重組質粒pETDUET-1-Fab。將重組質粒pETDUET-1-Fab轉入大腸桿菌BL21，加入IPTG誘導表達，經蛋白純化系統(tǒng)得到抗Siglec-9抗體Fab段。
　　2.抗 Siglc-9抗體 Fab段與抗原結合能力的鑒定和抗體親和力分析采用SDS-PAGE和 Western

4、 blot鑒定抗 Siglec-9抗體 Fab段，ELISA、流式細胞儀和Biacore X100分別檢測抗Siglec-9抗體Fab與Siglec-9的特異性結合能力和抗體的親和力。
　　3.抗Siglec-9抗體Fab的體外實驗抗Siglec-9抗體Fab作用于THP-1細胞分化的巨噬細胞和人單核外周血單核細胞來源的巨噬細胞，通過Q-PCR和ELISA分別檢測炎性細胞因子的表達量，通過Western blot檢測TLR4信號通

5、路上蛋白磷酸化水平的變化。
　　研究結果：
　　1.通過 PCR技術成功擴增抗體可變區(qū)，經測序驗證未產生無功能基因或發(fā)生基因突變，利用重疊延伸PCR技術連接抗體的可變區(qū)和恒定區(qū)，得到重組重鏈Fd和輕鏈L，重組原核系統(tǒng)表達質粒pETDUET-1-Fab成功構建。轉入大腸桿菌BL21表達，經蛋白純化系統(tǒng)純化得到抗Siglec-9抗體Fab。
　　2.SDS-PAGE和Western blot結果顯示抗Siglec-9抗體F

6、ab主要表達于上清中，分子量約27KD。ELISA、流式細胞儀結果顯示抗 Siglec-9抗體 Fab特異性結合Siglec-9。Biacore X100檢測得親和常數(shù)為6.58×10-7。
　　3.Q-PCR和ELISA顯示抗Siglec-9抗體Fab可有效的抑制促炎性細胞因子和促進抑炎性細胞因子的表達量，Western blot顯示抗Siglec-9抗體Fab可抑制TLR4信號通路上蛋白的磷酸化水平。
　　研究結論：