新型分泌蛋白Leg1a和Leg1b在斑馬魚肝臟發(fā)育中的功能研究.pdf

1、肝臟作為脊椎動物體內(nèi)一個功能重要的實體器官其發(fā)育過程相當復(fù)雜。肝臟的特化、分化，起始和生長過程是在包括肝臟富集基因在內(nèi)的一系列時空特異性因子的協(xié)同作用下完成的。已有的研究報道顯示人們對于肝臟發(fā)育過程中涉及的各種分子調(diào)控機制還了解得不多。
　　 本實驗室先前報道了一個新的功能未知的肝臟富集基因leg1。morpholino介導的基因敲低實驗顯示該基因的下調(diào)導致了肝臟發(fā)育變小的表型。為了能夠進一步明確該基因在斑馬魚肝臟發(fā)育中的作用，

2、本課題深入地分析了lee1在斑馬魚基因組中的結(jié)構(gòu)、定位，leg1表達特征及其在斑馬魚胚胎肝臟發(fā)育中的功能，同時還探討了Leg1敲低引起肝臟變小的分子機制。
　　 基因的結(jié)構(gòu)和定位分析結(jié)果顯示在斑馬魚基因組中l(wèi)eg1是一個重復(fù)基因，存在leg1a和leg1b兩個拷貝，它們串聯(lián)定位在第20號染色體上。leg1a和leg1b序列高度相似，編碼的蛋白結(jié)構(gòu)相同，都由N端信號肽和功能未知的DUF781結(jié)構(gòu)域組成通過對基因的表達分析證實在胚胎

3、期leg1a的表達占主導地位(占90％以上)；在成魚肝臟中l(wèi)eg1a仍為主表達基因，但leg1b表達大幅提高，legb的表達約占40％。本研究通過軟件預(yù)測結(jié)合實驗分析證實了Leg1是一個肝臟合成的新型的分泌蛋白，它在斑馬魚肝臟合成后隨著血液分布全身。在胚胎肝臟的發(fā)育中Leg1a與Leg1b功能都至關(guān)重要，它們的功能部分重疊但不完全相同。斑馬魚內(nèi)胚層器官特異探針的檢測結(jié)果顯示敲低Leg1的表達影響了肝臟的增長而不是肝芽的起始萌發(fā)，同時也影

4、響了腸和外分泌胰腺的生長發(fā)育。剔除信號肽的截短的Leg1蛋白不能夠拯救由MOATG morpholino引起的肝臟變小的表型，證明了信號肽的存在對Leg1的功能至關(guān)重要。實驗還進一步分析了敲低Leg1表達引起肝臟變小的分子機制，包括通過PH3免疫組化和TUNEL實驗分別檢測了MOATGmorpholino肝臟細胞的增殖和凋亡情況，結(jié)果發(fā)現(xiàn)Leg1功能的敲低引起肝臟變小的原因是由于肝臟細胞周期受到了抑制，而跟肝臟細胞的凋亡無關(guān)。
　

5、　 此外，本課題通過TILLING的方法，在ENU突變?nèi)后w中，篩選獲得了leg1a基因的兩個突變體c11和h11，這為以后剖析Leg1作為分泌蛋白在斑馬魚發(fā)育中的生理生化功能，特別是研究它在成魚中的作用奠定了一定的基礎(chǔ)。同時，實驗還通過蛋白免疫共沉淀技術(shù)在尋找Leg1的互作蛋白方面進行了一些有益的探索。
　　 綜合以上，我們推測Leg1很可能代表一類新型胞外信號因子，它在包括肝臟在內(nèi)的消化器官發(fā)育過程中可能扮演著重要角色。今后