新型分泌蛋白AKR1B10的分泌機(jī)制及其在乳腺癌分子診斷中的應(yīng)用研究.pdf

1、醛酮還原酶家族1成員B10(Aldo-keto Reductase family1，memberB10，AKR1B10)，也叫醛糖還原酶相似蛋白1(Aldo-keto ReductaseLike-Protein，ARL-1)主要表達(dá)于正常人的結(jié)腸和小腸組織，而在肝、胸腺、前列腺、睪丸和骨骼肌等組織中表達(dá)低。AKR1B10一方面還原醛酮類羰基化合物為相應(yīng)的醇類，保護(hù)DNA免于羰基毒性損傷和細(xì)胞免于癌變；另一方面AKR1B10穩(wěn)定乙酰輔酶A

2、羧化酶α(Acetyl-CoACarboxylase，ACCα)，阻止ACCα降解，從而調(diào)節(jié)脂質(zhì)合成，促進(jìn)腫瘤細(xì)胞生長(zhǎng)增值。因此，AKR1B10與腫瘤的發(fā)生發(fā)展密切相關(guān)。AKR1B10在肝癌、肺癌、子宮頸癌等多種腫瘤細(xì)胞中高表達(dá)，是吸煙導(dǎo)致的非小細(xì)胞型肺癌的病理學(xué)診斷標(biāo)記物。
　　 在本課題中，利用自行開(kāi)發(fā)的ELISA檢測(cè)法(已申請(qǐng)專利保護(hù)：US13/017，618)，我們發(fā)現(xiàn)AKR1B10可從腫瘤細(xì)胞內(nèi)分泌到細(xì)胞外。這種分泌現(xiàn)

3、象不但發(fā)生在腸癌細(xì)胞株HCT-8、HT29，肺癌細(xì)胞株H460、A549，乳腺癌細(xì)胞株MDA-MB-468，BT-20，肝癌細(xì)胞株HepG2等表達(dá)內(nèi)源性AKR1B10的腫瘤細(xì)胞株和轉(zhuǎn)染外源性AKR1B10基因的MCF-7乳腺癌細(xì)胞株。血清可刺激細(xì)胞分泌AKR1B10，而且與透析過(guò)的血清相比，平臺(tái)期的高度無(wú)明顯變化，但達(dá)到平臺(tái)期的時(shí)間更短；這提示血清小分子(離子)決定了分泌的速度，而血清大分子決定了分泌的峰值。AKR1B10的分泌量與細(xì)胞

4、數(shù)目正相關(guān)，但單位細(xì)胞分泌量與細(xì)胞密度負(fù)相關(guān)。分泌的AKR1B10仍然保留著與等量純蛋白酶同樣的活性。
　　 本課題還深入研究了AKR1B10分泌的機(jī)制。通過(guò)信號(hào)肽分析軟件，我們發(fā)現(xiàn)AKR1B10的氨基酸序列缺少分泌信號(hào)肽，所以推測(cè)AKR1B10并不能通過(guò)經(jīng)典的內(nèi)質(zhì)網(wǎng)-高爾基(ER-to-Golgi)分泌途徑分泌到細(xì)胞外的。AKR1B10的分泌不受蛋白翻譯抑制劑Cycloheximide(CHX)和ER-to-Golgi分泌途徑

5、抑制劑Brefeldin A的影響，說(shuō)明分泌的AKR1B10是已經(jīng)合成的，而與正在翻譯合成的AKR1B10無(wú)關(guān)，也與ER到Golgi體之間的轉(zhuǎn)運(yùn)無(wú)關(guān)。因此，AKR1B10的分泌途徑是非ER-to-Golgi依賴的非經(jīng)典途徑。
　　 溶酶體介導(dǎo)的分泌途徑是常見(jiàn)的非經(jīng)典分泌途徑。為了論證AKR1B10是否也是通過(guò)溶酶體途徑分泌的，我們分離了HCT-8細(xì)胞的溶酶體，發(fā)現(xiàn)AKR1B10存在溶酶體中；用熒光蛋白保護(hù)分析法發(fā)現(xiàn)，細(xì)胞被打孔劑

6、Digitonin和胰蛋白酶(Trypsin)處理后，胞漿內(nèi)絕大部分帶綠色熒光(EGFP)標(biāo)記的游離AKR1B10被消化掉了，而剩下的點(diǎn)狀EGFP-AKR1B10可與溶酶體共定位。這說(shuō)明AKR1B10存在于溶酶體。為了進(jìn)一步論證AKR1B10的分泌與分泌型溶酶體出胞的關(guān)系，我們用影響溶酶體出胞的因素如溫度、ATP、鈣離子(Ca2+)等處理HCT-8細(xì)胞，發(fā)現(xiàn)溫度越高，AKR1B10分泌越多，溫度越低，分泌越少，4℃時(shí)，分泌幾乎停止；提供

7、能量的ATP能促進(jìn)AKR1B10分泌；增加培養(yǎng)基中Ca2+濃度也可促進(jìn)AKR1B10的分泌，Ca2+跨膜轉(zhuǎn)運(yùn)體Ionomycin則顯著地促進(jìn)了AKR1B10的釋放。趨溶酶體藥氯化氨(MH4Cl)一方面可促進(jìn)溶酶體出胞，另一方面可阻止蛋白進(jìn)入溶酶體；因此，用NH4Cl預(yù)處理HCT-8細(xì)胞后，AKR1B10分泌減少了；而末預(yù)處理組，NH4Cl促進(jìn)了AKR1B10的分泌。同時(shí)，我們發(fā)現(xiàn)AKR1B10的釋放與溶酶體標(biāo)記物Cathepsin D的

8、釋放規(guī)律是一致的，這提示AKR1B10是通過(guò)溶酶體介導(dǎo)的非經(jīng)典途徑分泌的。分泌性溶酶體的出胞受調(diào)節(jié)細(xì)胞內(nèi)Ca2+濃度的信號(hào)通路所調(diào)節(jié)。AKR1B10的分泌受到這些通路中關(guān)鍵信號(hào)分子ADP核糖基化因子(ADP-ribosylation factor，ARF)抑制劑Exo-1、磷脂酶C(phospholipase C，PLC)抑制劑U73122的抑制，受G蛋白激動(dòng)劑GTPγS、G蛋白偶聯(lián)受體配體fMLP的刺激。進(jìn)一步證明了AKR1B10的分

9、泌是通過(guò)分泌性溶酶體的出胞介導(dǎo)的。
　　 本課題接著探討了AKR1B10進(jìn)入溶酶體的機(jī)制。我們用ATP結(jié)合盒超家族轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白(ATP-Binding cassette，ABC)的抑制劑4，4’-diisothiocyanatostilbene-2，2’-disulfonic acid(DIDS)和Glibenclamide(Glib)處理HCT-8細(xì)胞后，發(fā)現(xiàn)溶酶體內(nèi)AKR1B10含量顯著減少，分泌到細(xì)胞外的AKR1B10也相應(yīng)減

10、少。提示溶酶體膜上ABC轉(zhuǎn)運(yùn)體是轉(zhuǎn)運(yùn)AKR1B10進(jìn)入溶酶體的主要通道。
　　 本課題還證實(shí)了AKR1B10在體內(nèi)也是分泌蛋白。因?yàn)锳KR1B10主要表達(dá)于腸道上皮，因此我們收集了11例正常人的回腸液，檢測(cè)了其中AKR1B10濃度，發(fā)現(xiàn)AKR1B10特異性表達(dá)于成熟的腸道上皮細(xì)胞，并分泌到腸腔，濃度為188.6～535.7ng/ml(average=298.1ng/ml，n=11)。
　　 本課題進(jìn)一步探討了主要分布于胞

11、漿的AKR1B10轉(zhuǎn)運(yùn)到溶酶體的機(jī)制。用免疫共沉淀(CoIP)和Pulldown法發(fā)現(xiàn)熱休克蛋白90α(HeatShock Protein90 alpha，HSP90α)可與AKR1B10相互作用。HSP90α抑制劑Geldanamycin(GA)顯著地抑制了HCT-8細(xì)胞AKR1B10的分泌，降低了HSP90α與AKR1B10的結(jié)合，減少了AKR1B10在溶酶體內(nèi)的聚集。
　　 非經(jīng)典分泌蛋白通常包含一個(gè)與分泌相關(guān)的功能域。因

12、此，我們研究了不同AKR1B10肽段的分泌效率，以及它們與HSP90α的結(jié)合情況。通過(guò)構(gòu)建AKR1B10全長(zhǎng)和不同肽段(N端的N1-39、N1-83、N1-142、N1-231以及C端的C204-261、C204-316)的表達(dá)載體GST/pGEX，并將它們分別轉(zhuǎn)染到293T細(xì)胞中；與全長(zhǎng)AKR1B10的分泌效率相比，N端肽段(N1-231)不具有分泌功能；而C端肽段C204-261、C204-316的相對(duì)分泌效率可達(dá)74.2±3.0％

13、和81.5±5.5％。這提示介導(dǎo)AKR1B10分泌的功能域可能存在于C端肽段C204-261。接著，我們將螺旋10(氨基酸殘基233到240)上氨基酸殘基233K、236E和240K三個(gè)位點(diǎn)進(jìn)行了單點(diǎn)或聯(lián)合突變；與野生型AKR1B10相比，233K/A、236E/A和240K/A單點(diǎn)突變型AKR1B10的分泌效率分別下降到59.2±2.1％、63.3±1.1％和46.9±3.1％；而兩點(diǎn)聯(lián)合突變型AKR1B10的分泌效率減少到了43.1

14、5±1.5％(K233A和E236A聯(lián)合突變)、33.30±1％(K233A和K240A聯(lián)合突變)和33.52±3.1％(E236A和K240A聯(lián)合突變)；三點(diǎn)突變型AKR1B10的分泌效率只有野生型的18.2±3.2％。免疫共沉淀實(shí)驗(yàn)顯示，三點(diǎn)突變性AKR1B10喪失了結(jié)合HSP90α的能力；western blot分析表明，突變性AKR1B10在溶酶體內(nèi)的聚集顯著減少了。這些結(jié)果提示，螺旋10(aa233-240)通過(guò)與HSP90α

15、結(jié)合從而介導(dǎo)了AKR1B10的分泌；該螺旋中氨基酸位點(diǎn)233K、236E和240K是結(jié)合HSP90α的關(guān)鍵位點(diǎn)。
　　 最近，我們研究發(fā)現(xiàn)，AKR1B10在乳腺癌組織中過(guò)表達(dá)，可增加乳腺癌細(xì)胞的脂質(zhì)合成，促進(jìn)生長(zhǎng)增值，抑制醛酮類羰基化合物誘導(dǎo)的凋亡；AKR1B10高表達(dá)與乳腺癌的生長(zhǎng)、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移和存活率相關(guān)，提示AKR1B10是一個(gè)新的乳腺癌預(yù)測(cè)指標(biāo)。因此，本課題探討了開(kāi)發(fā)AKR1B10為診斷乳腺癌的血清學(xué)指標(biāo)的可行性。通過(guò)對(duì)乳

16、腺癌組織芯片進(jìn)行免疫染色發(fā)現(xiàn)，正常乳腺小葉和乳腺管低表達(dá)或不表達(dá)AKR1B10；而在28例原位乳腺管癌中，有20例(71.4％)AKR1B10高表達(dá)；在220例乳腺浸潤(rùn)癌中有184(83.6％)AKR1B10高表達(dá)；在32例術(shù)后復(fù)發(fā)乳腺癌中有28例AKR1B10高表達(dá)。此外，我們檢測(cè)了50例乳腺癌患者腫瘤組織中AKR1B10的表達(dá)和血液中AKR1B10的含量，發(fā)現(xiàn)48例乳腺癌組織中的AKR1B10表達(dá)水平要顯著高于癌旁正常組織的；血清中