bock1在斑馬魚胚胎頭部后腦血管發(fā)育中的功能研究.pdf

1、bock1是一個新型的膜結合天冬氨酸蛋白酶，是由501個氨基酸組成的Ⅰ型跨膜蛋白。研究發(fā)現(xiàn)，bock1基因能調節(jié)髓鞘形成，其在正常神經系統(tǒng)的發(fā)育中也起著關鍵作用。但是關于bock1斑馬魚體內的性質和功能方面的研究開展得仍然相當有限，其與人類和老鼠中表達部位不一致，而導致暫時無法預測其可能存在的底物和參與的代謝途徑。
　　血管生長是一個復雜的過程，它是在原有血管的基礎上出芽、遷移形成新的血管。因此這個過程與許多血管相關的疾病有密切關

2、系，此外血管生成對胚胎的發(fā)育也起著至關重要的作用。其中頭部血管系統(tǒng)的發(fā)育至關重要，其對于中樞神經系統(tǒng)的生存和發(fā)育都是必須的，對于腦中風及其他的大腦疾病影響也非常巨大。頭部血管的形成是可再生的，它的形成模式遵循一定的規(guī)律。斑馬魚的心血管系統(tǒng)在基因水平上85％與人類同源，早期發(fā)育與人類也極為相似。因此利用斑馬魚研究血管發(fā)育過程，及參與其中的重要因子的作用，可以為臨床醫(yī)學提供很好的理論基礎。
　　近年來，血管形成發(fā)育及再生的分子機制研究

3、取得了許多突破性進展。在生物體中，神經與血管一般都相伴相生，二者形成相似的網絡結構，而研究也表明，血管網絡與神經網絡的形成有許多共同的分子機制參與其中，二者相互調控。而在雞和斑馬魚的研究中將更多的分子信號途徑與血管網絡形成及神經網絡形成偶聯(lián)起來。
　　在本課題研究中，我們首先克隆出斑馬魚的bock1基因，通過全胚胎原位雜交對其在斑馬魚胚胎發(fā)育的不同時期的表達模式進行了研究，發(fā)現(xiàn)bock1在斑馬魚體內主要表達在頭部。然后利用斑馬魚轉

4、基因系Tg(flk1:GFP×gata1:DsRed)，綠色熒光蛋白(GFP)標記血管內皮細胞，紅色熒光蛋白(DsRed)標記血細胞，利用顯微注射技術，在1-2個細胞時期注射特異性的嗎啡林（morpholinos）修飾性寡核苷酸，并通過共聚焦顯微鏡觀察其形態(tài)學變化，實驗發(fā)現(xiàn)敲降內源性bock1之后，頭部血管叢在36hpf發(fā)生明顯的缺陷，尤其是腦血管BA和CtAs的形成缺陷。這些缺陷可以通過注射bock1mRNA被部分回救。其次注射boc

5、k1mRNA于胚胎中，觀察過表達bock1的表型發(fā)現(xiàn)，斑馬魚全身的血管形成分枝增多，形成模式有一定程度的紊亂。
　　血管網絡與神經網絡的形成有許多共同的分子機制參與其中，二者相互調控。bock1基因能調節(jié)髓鞘形成，組成髓鞘的施旺細胞能分泌VEGF使得動脈血管沿著神經纖維分布。而VEGF對于頭部后腦血管血管的出芽也有著重要的作用。因此利用標記與VEGF信號相關的的分子探針vegfa，vegfc、flt4，dll4，和組成髓鞘的施旺細

6、胞相關的分子探針gfap進行全胚胎原位雜交，實驗發(fā)現(xiàn)vegfa、flt4、dll4和gfap在敲降內源性bock1基因的胚胎中表達均下調;在共注射bock1MO和vegfamRNA的胚胎中發(fā)現(xiàn)，vegfamRNA能部分回救敲降bock1對頭部血管造成的表型。結果表明，bock1基因影響頭部后腦的血管發(fā)育，且該過程可能與VEGF信號有關，主要通過施旺細胞介導，通過vegfa起作用。
　　隨后，為了進一步對bock1與vegfa相互作

7、用機制進行深入研究，我們對bock1具體表達的組織進行進一步定位。首先利用斑馬魚轉基因系Tg(flk1:GFP×gata1:DsRed)，綠色熒光蛋白(GFP)標記血管內皮細胞，紅色熒光蛋白(DsRed)標記血細胞。收集其30hpf的斑馬魚胚胎的頭部，通過流式細胞儀分選出頭部的綠色熒光細胞和紅色熒光細胞，檢測bock1在血管或者血液中是否有表達。但在隨后的RT-PCR實驗中，并不能擴增出bock1特異性的條帶，證明bock1并不在血管和