食品免疫學(xué) 免疫檢測(cè)技術(shù)與食品安全檢測(cè)

1、西北農(nóng)林科技大學(xué)食品學(xué)院免疫學(xué)課件第八章免疫學(xué)技術(shù)1第八章第八章免疫學(xué)技術(shù)免疫學(xué)技術(shù)第一節(jié)第一節(jié)抗原抗體的制備抗原抗體的制備一、抗原的制備一、抗原的制備制備特異性的抗原是制的合格抗體的前提條件，而作為檢測(cè)診斷的抗原也必須是純化的抗原?？乖奈镔|(zhì)很多，很少是單一成分，必須從復(fù)雜的組分中提取分離。按抗原的物理狀態(tài)，可分為天然抗原、人工抗原和合成抗原三類。1、天然抗原的制備、天然抗原的制備（1）顆粒性天然抗原常見的顆?？乖▌?dòng)物、植物、微生

2、物的細(xì)胞，和有關(guān)的細(xì)胞組成結(jié)構(gòu)，如細(xì)胞的細(xì)胞壁、線粒體，細(xì)菌的鞭毛和菌毛等。一般步驟為：首先收集抗原細(xì)胞或（和）擴(kuò)增培養(yǎng)，然后離心或過濾收集細(xì)胞或細(xì)胞組成結(jié)構(gòu)物，再進(jìn)行病原微生物滅活。（2）可溶性抗原的分離純化蛋白質(zhì)、糖蛋白、脂蛋白、酶、補(bǔ)體、細(xì)菌毒素、免疫球蛋白片段、核酸等皆為良好的可溶性抗原，免疫前常需純化。細(xì)胞破碎方法有：凍融法；超聲破碎；高速組織搗碎機(jī)法；研磨法；溶菌酶、蝸牛酶、纖維素酶處理可溶性蛋白抗原的分離方法：離心分離法：

3、差速離心、密度梯度離心選擇沉淀法：鹽析沉淀法；有機(jī)溶劑沉淀法，常采用乙醇或丙酮核酸去除法，DNA酶、RNA酶處理；水溶性非離子型聚合物沉淀法：常用非離子型聚合物為分子量為2000～6000的聚乙二醇（PEG）凝膠過濾法：又稱分子篩層析。通過凝膠分子篩作用，可將大、中、小三類分子分開，選擇凝膠柱時(shí)應(yīng)注意選用適于分離范圍內(nèi)的凝膠。離子交換層析法：離子交換層析是利用一些帶電離子基團(tuán)的凝膠或纖維素吸附帶有相反電荷的蛋白質(zhì)抗原。親和層析法：親和層

4、析是利用生物分子間所具有的專一性親和力而設(shè)計(jì)的層析技術(shù)。如抗原和抗體、酶和酶抑制物、酶蛋白和輔酶、激素和受體、DNA和RNA等之間有特殊親和力，一定條件下，兩者可緊密結(jié)合成復(fù)合物，如將復(fù)合物的一方固定于固相載體上，則可從溶液中分離和提純另一方。純化抗原的鑒定主要對(duì)純化抗原的含量、理化性質(zhì)、純度及免疫活性進(jìn)行鑒定，常用方法有酚試劑法、聚丙烯酰胺凝膠電泳法、免疫電泳法、免疫雙擴(kuò)散法等。2、人工抗原的制備、人工抗原的制備人工抗原指經(jīng)過人工修飾

5、的半抗原，即將半抗原與載體連接后形成的完全抗原。小分子半抗原可以是多糖、多肽、核酸、類固醇激素、某些藥物及其它化學(xué)物品。在食品檢驗(yàn)中常見的小分子半抗原有各種農(nóng)藥、獸藥、添加劑與非法添加物（鹽酸克倫特羅）、真菌毒素等等。常用載體：蛋白質(zhì)、多肽聚合物、大分子聚合物。西北農(nóng)林科技大學(xué)食品學(xué)院免疫學(xué)課件第八章免疫學(xué)技術(shù)3（2）免疫途徑與免疫間隔時(shí)間免疫途徑通常有皮內(nèi)、皮下、肌肉、靜脈、腹腔、淋巴結(jié)等，視不同的免疫方案而異。對(duì)于不易獲取的寶貴抗原

6、可采用淋巴結(jié)免疫法。免疫間隔時(shí)間是影響抗體產(chǎn)生的重要因素，其中首次與第二次免疫的間隔時(shí)間尤為重要，一般以2～3周為佳，二次后間隔時(shí)間一般為1周，若間隔時(shí)間太長(zhǎng)，則刺激減弱，抗體效價(jià)不高。3、動(dòng)物采血、動(dòng)物采血采集免疫血清前，要預(yù)先測(cè)試抗體效價(jià)測(cè)定，若效價(jià)達(dá)到要求，應(yīng)在末次免疫后一周及時(shí)采血，否則抗體效價(jià)會(huì)下降。(1)頸動(dòng)脈采血法(2)心臟采血法(3)靜脈采血法4、免疫血清的鑒定、免疫血清的鑒定（1）效價(jià)的測(cè)定效價(jià)，又叫滴度，是稀釋度的倒

7、數(shù)，指通過血清學(xué)方法能顯示一定反應(yīng)的抗體或抗血清的最高稀釋倍數(shù)，如終點(diǎn)稀釋度為1100，效價(jià)(每1ml的血清中抗體效價(jià))為100抗體單位。顆粒性抗原可采用凝集試驗(yàn)?？扇苄钥乖Ｓ秒p向免疫擴(kuò)散試驗(yàn)、ELISA等方法。（2）特異性的鑒定抗體特異性鑒定常用雙向免疫擴(kuò)散法、免疫電泳法。（3）純度的鑒定抗體純度的鑒定可采用SDS聚丙酰胺凝膠電泳（SDSPAGE）、雙向擴(kuò)散試驗(yàn)、免疫電泳等方法。（4）親和力的鑒定抗體結(jié)合部位與抗原表位之間結(jié)合的強(qiáng)度

8、。測(cè)定抗體親力的方法較多，如平衡透析法、ELISA或RIA競(jìng)爭(zhēng)結(jié)合試驗(yàn)等。5、免疫血清的保存、免疫血清的保存（1）4℃保存（6個(gè)月）（2）低溫保存（70℃～20℃，5年）（3）真空干燥保存（5～10年）注意點(diǎn)：保存前需經(jīng)除菌保存液含防腐劑避免反復(fù)凍融（分裝）三、單克隆抗體的制備三、單克隆抗體的制備單抗：由一個(gè)識(shí)別單一抗原決定簇（表位）的B細(xì)胞克隆所產(chǎn)生的同源抗體。單抗制備過程1、致敏淋巴細(xì)胞的準(zhǔn)備2、骨髓瘤細(xì)胞的準(zhǔn)備3、飼養(yǎng)層細(xì)胞的準(zhǔn)備