免疫檢測技術

1、,第九章,免疫檢測技術,免疫檢測是目前生物學檢測方法中用途最廣泛的一種方法。具有高度精確、靈敏、特異的特點。可用于免疫學的基礎理論和應用研究，也可應用于生物學研究的各個領域。,1 、免疫疾病診斷 2 、動物植物生理活動研究（激素、維生素） 3 、物種及微生物鑒定 4 、動物、植物性狀的免疫標記 5 、免疫增強藥物和疫苗的研究 6 、發(fā)病機理研究 7 、分子生物學研究,免疫檢測技術在生物科學領域中的應用

2、：,第一節(jié) 抗原抗體反應原理,抗體能特異性地識別相應的抗原，并與之結合。這種結合在體外也能發(fā)生，當抗原和抗體在體外特異性結合后可出現(xiàn)肉眼可見或借助儀器可檢測出的反應現(xiàn)象。 試驗時既可用已知抗體檢測標本中有無相應抗原，也可用已知抗原檢測標本中有無相應抗體。,這種特性就是許多免疫檢測方法的基礎!!,一、體外抗原抗體反應的特點,①特異性：抗原抗體反應具有高度的特異性。②可逆性：抗原抗體反應所形成的復合物較穩(wěn)定，

3、 但在一定條件下可解離。（低酸、高鹽）③比例性：抗原抗體的比例合適，才可出現(xiàn)可見的 反應現(xiàn)象。（網(wǎng)格理論）④階段性：特異性結合階段和可見反應階段。,網(wǎng)格理論——解釋抗原抗體形成沉淀的機制,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,網(wǎng)格學說（lattice theory）,抗體過剩,抗原過剩,抗體抗體比例合適,抗原,,抗體,二、影響抗原抗體反應的因素,①溫度：在一定溫度范圍內(nèi)，提

4、高溫度可加速反應 速度，縮短反應時間，常用反應溫度為37-45℃。②溶液的pH：pH過高或過低可改變抗原和抗體理化 性質(zhì)，影響反應結果，因此溶液的pH應適宜 （pH 6-8）。③電解質(zhì)：反應中必須有適宜的電解質(zhì)（0.85%NaCl） 參與，否則不出現(xiàn)可見反應。,三、抗原抗體反應類型,1.沉淀反應2.凝集反應3.補體參與的反應4.中和反應5.免疫標記技術,第二節(jié) 常見免疫檢測方法

5、,可溶性抗原（血清蛋白、病毒抗原、細胞裂解液或組織液等）與相應抗體結合，在一定條件下形成肉眼可見的沉淀物稱沉淀反應。,一、免疫沉淀反應,一、免疫沉淀反應,1. 液相沉淀反應,2. 凝膠擴散沉淀,3. 凝膠免疫電泳,,絮狀沉淀,環(huán)狀沉淀,免疫濁度沉淀,單向瓊脂擴散試驗,,雙向瓊脂擴散試驗,血清免疫電泳,火箭電泳,對流免疫電泳,免疫印跡等,,,,,,絮狀沉淀試驗,操作步驟：（1） 將可溶性抗原作一系列倍比稀釋。（2） 各管加入一定濃度的

6、適量抗血清。（3） 振搖使抗原、抗體充分混勻，置37℃孵育。（4） 產(chǎn)生沉淀量隨抗原量而不同，以出現(xiàn)沉淀物最多的管為最適比例管。 絮狀沉淀試驗方法簡單，設備要求低，敏感度較低，目前多用以測定抗原抗體反應的最適比。,,環(huán)狀沉淀試驗,操作步驟：（1） 用毛細滴管吸取抗血清加于沉淀管（5×50mm）底部，避免產(chǎn)生氣泡。（已知！）（2） 將抗原溶液沿管壁緩緩疊加于抗血清液面上，形成清晰的交界面。（待測！ ）（3）

7、置沉淀管于室溫下使其反應，1~5min內(nèi)在兩界面間呈現(xiàn)乳白色沉淀環(huán)為陽性。30min仍無沉淀環(huán)出現(xiàn)則為陰性。應用：主要用于抗原的定性試驗。用已知抗體來檢測未知抗原。 （診斷炭疽的Ascoli實驗、細菌分型、血跡鑒定）。,,2. 凝膠擴散沉淀,凝膠擴散沉淀是指抗原與抗體在凝膠介質(zhì)中自由擴散形成濃度梯度，抗原與抗體在比例合適的擴散部位相遇形成沉淀線的反應。常用的凝膠有瓊脂、瓊脂糖、葡聚糖或聚丙稀酰胺凝膠等。最常用的方法為：

8、 ①單向瓊脂擴散試驗 ②雙向瓊脂擴散試驗,單向瓊脂擴散試驗,原 理： 將適當濃度的抗體混入瓊脂凝膠中，瓊脂凝固后，打成小孔，加入待測的抗原物質(zhì)，使抗原在凝膠中由小孔自由向周圍擴散，并在小孔周圍合適的位置與抗體結合形成沉淀環(huán)，沉淀環(huán)的大小與抗原濃度呈正相關。,單向免疫擴散試驗示意圖,雙向免疫擴散試驗,雙向免疫擴散試驗是在瓊脂板上按一定距離打數(shù)個小孔，在相鄰的兩孔內(nèi)分別放入抗原和抗體材料。當抗

9、原和抗體向四周凝膠中擴散，在兩孔間可出現(xiàn)2～3條沉淀線，本法常用于抗原或抗體的定性或定量檢測，或用于兩種抗原材料的抗原相關性分析。,,,,3.免疫電泳技術,免疫電泳技術是電泳分析與沉淀反應的結合產(chǎn)物。這種技術有兩大優(yōu)點：一是加快了沉淀反應的速度，二是將某些蛋白組分利用其帶電荷的不同而將其分開，再分別與抗體反應，以此作更細微的分析。免疫電泳包括:血清免疫電泳、對流免疫電泳、火箭電泳、免疫印跡等,血清免疫電泳,將抗原混合物

10、（病人血清）在凝膠中用電泳分離后，沿電泳方向挖一平行的小槽，加入抗血清，進行雙向擴散。沉淀線的特點顯示病人血清與正常人血清存在的差異，即血清蛋白組分的缺少或增加。,免疫電泳原理圖解,火箭免疫電泳,火箭免疫電泳技術又稱作單向電泳擴散免疫沉淀試驗，它是由單向擴散發(fā)展起來的一項定量技術，實質(zhì)上是加速度的單向擴散。,,沉淀線的高度與抗原量成正比,火箭電泳圖,二、凝集反應（Agglutination）,顆粒性抗原（如細菌、細胞）與相

11、應抗體，在適當電解質(zhì)存在的條件下，經(jīng)過一定時間后出現(xiàn)肉眼可見凝集塊稱為凝集反應。 1、直接凝集：將細菌或紅細胞與相應的抗體直接反應，出現(xiàn)細菌凝集或紅細胞凝集現(xiàn)象。又分為玻片法和試管法。 2、間接凝集：將可溶性抗原包被在紅細胞或乳膠顆粒表面，與相應抗體反應出現(xiàn)顆粒凝集現(xiàn)象。,,妊娠免疫診斷試驗,孕婦尿中，絨毛膜促性腺激素（HCG）含量明顯增高。（HCG是可溶性抗原 ）反之，非孕婦尿中HCG含量甚微，不足以消耗掉抗HCG抗體。

12、,三、補體結合實驗,（2個系統(tǒng)，5種成分）,已知抗原加入血清（檢測抗體）,加入標準量補體,加入包被抗體的紅細胞,檢測紅細胞溶解情況,Ag,,Ag,,,,,,,,,三、補體結合實驗,（2個系統(tǒng)，5種成分）,免疫標記技術是采用酶、熒光素、放射性核素等標記物標記抗原或抗體所進行的抗原抗體反應。免疫標記技術既可對樣品作定性、定量檢測，也可進行定位分析，且大大提高了方法的靈敏度，是目前應用最廣泛的免疫學檢測技術。,四、免疫標記技術,,常見標記免

13、疫技術,放射免疫技術酶免疫技術熒光免疫技術,四、免疫標記技術,該法是用放射性核素作為標記物標記抗原或抗體所進行的抗原抗體反應，盡管放射免疫技術需特殊儀器設備且有一定的放射性危害，但由于其具有高度的靈敏度（pg）和自動化檢測等特點，因此在實驗研究和臨床檢測中仍被廣泛應用。主要用于激素、小分子藥物、腫瘤標志物等小分子化合物的定量分析。,1. 放射免疫技術（125I）,放射免疫分析－基本原理,競爭性結合反應的經(jīng)典標記抗

14、原（Ag*）和非標記抗原（Ag）與限量抗體(Ab)競爭性結合Ag*和Ag具有等同的與Ab結合能力,,,,,放射免疫測定法(RIA)示意圖,RIA法原理及標準曲線,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,75,50,30,10,,,,,,0,1,10,100,1000,未標記抗原濃度（ng/mL),結合/未結合的放射活性（%）,,Ag*-Ab,Ag*,將熒光素（異硫氰酸熒光素或羅丹明等）標記抗體，制成熒光抗體診斷試劑。

15、用熒光顯微鏡觀察熒光的產(chǎn)生或熒光強度，以此判斷抗原的存在、定位和分布情況。免疫熒光技術有直接法和間接法等。,2. 免疫熒光技術,免疫熒光技術——直接法,,免疫熒光技術——間接法,,免 疫 熒 光 染 色 顯 示 細 胞 骨 架,免疫熒光染色是利用抗原－抗體特異性結合的原理，用經(jīng)熒光染料標記的抗體對細胞或組織內(nèi)的蛋白質(zhì)進行定性或定量研究的方法。該技術與熒光顯微鏡觀察相結合，可對特定的蛋白質(zhì)進行細胞或組織內(nèi)的精確定位。,常用于抗原、抗

16、體標記的熒光染料有以下幾種顯示綠色熒光：Fluorescein isothocyancie(FITC),Alexa-488顯示紅色熒光：Rhodamine B, Texas Red, Alexa-546,568,594顯示藍色熒光：Alexa－350,用Alexa488標記的抗人α-tubulin抗體染色顯示微管(綠色); 細胞核: 紅色, DAPI染色,人皮膚角化細胞免疫熒光染色,用抗α-tubulin抗體染色顯示微管(綠色);

17、 細胞核: 紅色, DAPI染色(激光共聚焦顯微鏡照片),PtK1細胞免疫熒光染色,本法是抗原抗體反應的特異性與酶對底物的高效催化活性相結合的免疫檢測技術。酶標記的抗原或抗體與待檢標本中的相應成分特異性結合，根據(jù)酶作用底物后的顏色變化，采用肉眼或酶標檢測儀分析、判斷結果。常用方法有酶聯(lián)免疫吸附試驗和酶免疫組化法，前者用于檢測可溶性抗原或抗體，后者常用于檢測組織中或細胞表面的抗原。,3. 免疫酶測定法,是在固相載體（通常為

18、聚苯乙烯反應板）表面進行的抗原抗體反應。實驗中常用的酶是辣根過氧化物酶（HRP），底物為二苯基聯(lián)苯胺。,酶聯(lián)免疫吸附試驗（ELISA）：,ELISA試驗三個必要的試劑,(1)固相的抗原或抗體（免疫吸附劑）(2)酶標記的抗原或抗體（標記物）(3)酶作用的底物（顯色劑）,,底物顯色定性或定量的分析,原理,包被,反應加入待測抗體或抗原和酶標抗原或抗體,洗滌使結合在固相上的抗原抗體復合物與未結合的分離,1,2,3,4,基

19、本步驟,五種常見的檢測方法,1 雙抗夾心法（測定抗原）2 測定抗體的間接法3 競爭法（測定抗原）4 捕獲包被法測IgM抗體 5 ABS-ELISA法,適用于測定二價或二價以上的大分子抗原，但不適用于測定半抗原及低于二價的小分子單價抗原，因其不能形成兩位點夾心,,1 雙抗夾心法測抗原,,2 間接法測抗體,幾種標記/檢測技術靈敏度的比較,酶標,熒光,放免,發(fā)光,靈敏度(mol/L),10-1810-1510-12

20、10-9,幾種標記/檢測試劑的有效期比較,酶標,熒光,放免,發(fā)光,有效期（月）,1815129630,人民幣,,,人民幣,三種免疫測定技術的成本及費用,,三種免疫測定技術的成本及費用,,放免,酶標,發(fā)光,A. 將Ab吸附在固相載體表面; B. 加入酶標Ag和待測Ag，競爭結合Ab； 對照只加入酶標Ag； C. 加底物。對照孔與樣品孔底物降解量的差＝未知Ag量。,3 競爭法測定抗原,血清標本中的I

21、gM包括針對抗原的特異性IgM抗體和非特異性的IgM 加入特異性抗原試劑：它只與固相上的特異性IgM結合 抗人IgM抗體包被 加入血清標本 加入特異性抗原試劑 加入針對特異性抗原的酶標抗體 加底物顯色,,,,,4 捕獲包被法測IgM抗體,捕獲法,原理：抗人IgMμ鏈抗體包被捕獲待測標本中IgM類抗體加入特異性抗原和酶標記特異性抗原的抗體 底物顯色,,,,ABS為親和素(avi

22、din)生物素(biotin)系統(tǒng)(system)的略語。親和素是一種糖蛋白，生物素為小分子化合物。親和素與生物素的結合，雖不屬免疫反應，但特異性強，親和力大，兩者一經(jīng)結合就極為穩(wěn)定。 1個親和素分子可與4個生物素分子結合。因此把親和素和生物素與ELISA偶聯(lián)起來，就可提高ELISA的敏感度。,5 ABS-ELISA法,ABS-ELISA法,①：固相支持物；②：樣品；③：特異性IgG；④：生物素化抗小鼠IgG （Bi