氯霉素基因工程抗體制備與免疫檢測技術(shù)建立.pdf

1、各類獸藥的大量使用，雖然提高了動物性食品的產(chǎn)量，但是也對人類健康造成了潛在威脅。同時獸藥殘留問題也影響著我國動物性食品的出口貿(mào)易。免疫分析方法是目前獸藥殘留檢測使用較多的方法?？贵w作為免疫分析的核心試劑，其穩(wěn)定性是影響免疫檢測分析結(jié)果的關(guān)鍵因素。本論文利用分子生物學技術(shù)獲得了氯霉素的基因工程抗體，并利用這一抗體建立了免疫檢測方法，為氯霉素的檢測提供了一種有效、穩(wěn)定的檢測技術(shù)。
　　從分泌氯霉素單克隆抗體的雜交瘤細胞株10A3B6E

2、中提取總RNA，并反轉(zhuǎn)錄成cDNA。以cDNA為模板，利用兼并引物進行PCR擴增，獲得抗體基因的重鏈可變區(qū)(VH)和輕鏈可變區(qū)(VL)，將其連接到pMD18-T載體后進行大規(guī)模測序。同時，利用木瓜蛋白酶對單克隆抗體進行水解獲得Fab，SDS-PAGE電泳后，對Fab中的輕鏈和重鏈分別進行Orbitrap質(zhì)譜分析，獲得其中的氨基酸片段。將可變區(qū)測序結(jié)果與質(zhì)譜鑒定結(jié)果進行比對分析，獲得了氯霉素特異性抗體可變區(qū)序列，重鏈可變區(qū)和輕鏈可變區(qū)的長

3、度分別為341 bp和324 bp。利用重疊延伸PCR將重鏈可變區(qū)、輕鏈可變區(qū)及連接片段進行連接，獲得了711 bp的單鏈抗體(scFv)基因片段。將該片段用內(nèi)切酶SfiⅠ和NotⅠ進行酶切，并與經(jīng)過相同酶切的表達載體pLIP6/GN進行連接，轉(zhuǎn)化BL21(DE3)后，對scFv進行重組表達。在25℃，180 rpm振蕩培養(yǎng)條件下，利用0.1mmol/L IPTG對表達菌株誘導10-14小時，成功獲得出可溶性的抗氯霉素單鏈抗體-堿性磷酸

4、酶融合蛋白(CAP scFv-AP)。利用Ni2+-NTA親和層析柱對CAP scFv-AP進行分離純化。利用純化后的蛋白，通過對免疫分析條件的優(yōu)化，建立了一種簡便、快捷、實用的氯霉素直接競爭ELISA檢測方法。優(yōu)化后的檢測條件為:包被原包被量0.1μg/孔;封閉液1％脫脂乳粉;樣品稀釋液0.02 mol/L TBS(pH5.7)。在最佳條件下，該檢測方法的檢測靈敏度(IC50)與檢測限(IC15)分別為6.92±0.24 ng/mL和

5、1.11±0.05 ng/mL。選擇3種氯霉素結(jié)構(gòu)類似物和2種獸藥進行特異性分析，結(jié)果顯示該檢測方法對氯霉素琥珀酸鈉、氟甲砜霉素、甲砜霉素、四環(huán)素、鏈霉素的交叉反應(yīng)率分別為42.34％、0.37％、0.22％、0.22％和0.12％，說明所建立的檢測方法具有較好的特異性。選擇對蝦和鱈魚作為實際樣品，分別向其添加10、30、100 ng/g氯霉素，測得其回收率為72.53％-107.67％，變異系數(shù)小于10％，表明方法具有較好的精密度。<