新型HIV免疫檢測平臺的建立.pdf

1、艾滋病是由人類免疫缺陷病病毒(HIV)感染引起的一種嚴重威脅人類健康的疾病。HIV快速檢測對病情控制、藥物療效以及血液篩查等也十分重要。傳統(tǒng)的檢測方法存在試劑消耗量大、分析時間長、操作過程繁瑣、靈敏度不高等缺點。采用芯片實驗室檢測HIV可能解決以上問題。但是傳統(tǒng)檢測技術不能直接移植到芯片實驗室中使用,因此,有必要建立一種適用于芯片實驗室的檢測技術。 納米金磁顆粒是包被有納米金外殼的納米級磁性復合微粒,具有超順磁性、懸浮穩(wěn)定性等特

2、點可以很好地解決生物大分子在芯片實驗室微通道中的操縱。同時納米金微粒具有大的比表面積,標記方法簡單、效率高。本研究利用納米金磁微粒作為一種新的生物分子標記技術,結(jié)合核酸等溫擴增技術建立新型的HIVp24免疫檢測平臺,完成了以下研究內(nèi)容： 第一、以納米金磁包被p24第一抗體,制備了納米金磁探針,其包被率達86.47％；采用納米金磁作為包被載體,使整個反應在均相溶液中進行,比傳統(tǒng)的固相反應具有更高的反應效率。 第二、以納米金

3、標記p24第二抗體和報告DNA分子,制備了納米金探針,其抗體標記率達87.12％,報告DNA標記率達34.05％。以納米金作為抗體和報告DNA的連接物,將檢測p24的免疫信號轉(zhuǎn)化為報告DNA的核酸信號。通過定量分析表明,一個納米金顆?？梢越Y(jié)合幾個抗體分子和幾十個報告DNA分子。 第三、建立了針對報告DNA檢測的TMA等溫擴增技術,且初步實現(xiàn)了實時檢測。與傳統(tǒng)的PCR相比,采用TMA等溫擴增技術檢測核酸信號具有與PCR同等的擴增效

4、率,但在恒溫條件下擴增,不需要復雜的變溫系統(tǒng),由此簡化了芯片實驗室的設計。 第四、克隆并純化了TMA的工具酶-MMLV-RT,酶純度達96％,且具有商業(yè)RT酶的同等活力。 第五、建立了基于納米標記技術和等溫擴增技術的新型HIV p24檢測平臺,其檢測靈敏度達0.1fg/mL。 該檢測技術與芯片實驗室相結(jié)合,可以建立低成本、高靈敏度、便捷的免疫檢測平臺,除了HIV檢測外,還可以用于其他病原微生物的檢測,在臨床診斷、