甾體類激素的化學(xué)發(fā)光免疫檢測方法的建立及應(yīng)用.pdf

1、睪丸酮叢毛單胞菌含有降解甾核的關(guān)鍵酶-17β-羥類固醇脫氫酶(17β-HSD)。在甾體類化合物存在時，睪丸酮叢毛單胞菌會分泌17β-HSD酶，進而通過許多酶的氧化甾核復(fù)雜代謝途徑將甾體類化合物徹底降解。
　　本課題從睪丸酮叢毛單胞菌染色體DNA中克隆得到17β-HSD的基因，將其重組到質(zhì)粒pET-15b中，得到重組質(zhì)粒pET-15b～17β-HSD。然后又將重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)化到大腸桿菌BL21中，并用1mMIPTG誘導(dǎo)大腸桿菌表達(dá)17α

2、-HSD蛋白。菌體破碎后收集表達(dá)的蛋白，用鎳柱進行純化，制備了濃度為3.65mg/ml的17β-HSD蛋白。
　　17β-HSD蛋白免疫兔子，收集兔血清，制備了多克隆抗體。間接ELISA法確定多克隆抗體的最佳工作濃度為4000倍稀釋。17β-HSD蛋白免疫小鼠，取脾細(xì)胞通過細(xì)胞融合技術(shù)與骨髓瘤細(xì)胞融合，獲得了高效表達(dá)抗17β-HSD的單克隆抗體的雜交瘤細(xì)胞株。然后制備抗17β-HSD的單克隆抗體，并用辛酸硫酸銨法和G蛋白親和層析柱

3、純化了單克隆抗體。最后用辣根過氧化酶標(biāo)記單克隆抗體，獲得酶標(biāo)抗體。間接ELISA法確定酶標(biāo)抗體的最佳工作濃度為8000倍稀釋。
　　用上述制備的多克隆抗體和酶標(biāo)抗體建立了化學(xué)發(fā)光雙抗體夾心法檢測甾體類激素的方法，并用來初步應(yīng)用。對新立城水庫、伊通河、飲馬河、長春市自來水四個地方的水樣進行了檢測，檢測結(jié)果為0.621ng/ml、9.332ng/ml、5.287ng/ml、0.321ng/ml。高效液相檢測結(jié)果與建立的方法檢測的結(jié)果相