基于金磁微粒的化學發(fā)光免疫學檢測梅毒螺旋體抗體方法的建立.pdf

1、梅毒是由梅毒螺旋體(Treponema pallidun，TP)感染引起的性傳播疾病，具有高度傳染性，是嚴重危害人類健康的傳染病之一。近年來我國梅毒發(fā)病率呈明顯上升趨勢，因此，在蛋白或核酸水平建立梅毒的快速、高靈敏檢測方法對該病的預防、治療及預后至關重要。血清學檢測梅毒螺旋體抗體是目前臨床診斷梅毒的重要方法，包括性病實驗室研究試驗(VDRL)、熒光螺旋體吸收試驗(FTA—ABS)、梅毒螺旋體血球凝集試驗(TPHA)、酶聯(lián)免疫吸附試驗(E

2、LISA)等。近年來，隨著梅毒螺旋體TP人工重組抗原技術的進步，以酶標板為載體，結合梅毒混合抗原，通過免疫學雙抗原夾心比色法檢測梅毒抗體已成為國內三甲級以上醫(yī)院通用的診斷方法，也是血站對梅毒螺旋體IgM和IgG抗體篩查的指定方法，但方法靈敏度尚需進一步提高。鑒于靈敏度較高的核酸檢測方法尚無法在醫(yī)院和血站大規(guī)模推廣，因此，提高梅毒螺旋體抗體免疫學檢測方法的靈敏度具有重要意義。 結合磁性納米粒子的超順磁性和金表面生物分子可修飾性的

3、雙重特質，本課題組研制了Fe3O4/Au磁性復合微粒，并將其實現(xiàn)了商業(yè)化(金磁微粒GoldMag(R))。本研究以金磁微粒為載體，結合化學發(fā)光檢測系統(tǒng)，建立了TP抗體的磁酶免化學發(fā)光檢測方法。研究內容包括4個部分：①TP混合抗原免疫磁珠的制備；②磁分離酶聯(lián)免疫反應條件的優(yōu)化；③化學發(fā)光檢測系統(tǒng)的優(yōu)化；④TP抗體磁酶免化學發(fā)光法檢測方法的評價。 將重組梅毒螺旋體混合抗原(包括TP47、TP44.5、TP17和TP15)包被在金磁微

4、粒(平均粒徑5μm)表面，在與被檢樣品以及辣根過氧化物酶(HRP)標記的混合抗原的雙抗原夾心酶聯(lián)免疫反應后，HRP結合在磁粒表面，然后引入化學發(fā)光物質魯米諾，通過HRP催化魯米諾的化學發(fā)光強度的讀取實現(xiàn)對樣品中梅毒螺旋體抗體的檢測。結果表明，TP抗原包被量為5μg/mg，方陣實驗結果顯示HRP標記抗原的最佳工作濃度為1：3000稀釋，選擇免疫學反應的溫育時間為30 min，以1×PBS緩沖液(pH8.0)為化學發(fā)光緩沖介質，魯米諾、過氧

5、化氫及對碘苯酚的濃度分別為1×10-3 mol/L，1×100 mL/L和3×10-3 mol/L，建立了TP陽性血清稀釋倍數(shù)與其相對發(fā)光強度之間的標準曲線，方法具有良好的線性關系，R2=0.9988。與以酶標板為載體測定TP抗體的商品化試劑盒(ELISA法)做了比較，單純以金磁微粒為固相載體的檢測靈敏度可提高2倍，若進一步引入化學發(fā)光檢測系統(tǒng)，其靈敏度可提高16倍。本方法對陽性血清重復測定11次的結果顯示，其相對標準偏差(RSD)為5