基于金磁微粒的化學(xué)發(fā)光免疫學(xué)檢測梅毒螺旋體抗體方法的建立.pdf

1、梅毒是由梅毒螺旋體(Treponema pallidun，TP)感染引起的性傳播疾病，具有高度傳染性，是嚴(yán)重危害人類健康的傳染病之一。近年來我國梅毒發(fā)病率呈明顯上升趨勢，因此，在蛋白或核酸水平建立梅毒的快速、高靈敏檢測方法對該病的預(yù)防、治療及預(yù)后至關(guān)重要。血清學(xué)檢測梅毒螺旋體抗體是目前臨床診斷梅毒的重要方法，包括性病實驗室研究試驗(VDRL)、熒光螺旋體吸收試驗(FTA—ABS)、梅毒螺旋體血球凝集試驗(TPHA)、酶聯(lián)免疫吸附試驗(E

2、LISA)等。近年來，隨著梅毒螺旋體TP人工重組抗原技術(shù)的進(jìn)步，以酶標(biāo)板為載體，結(jié)合梅毒混合抗原，通過免疫學(xué)雙抗原夾心比色法檢測梅毒抗體已成為國內(nèi)三甲級以上醫(yī)院通用的診斷方法，也是血站對梅毒螺旋體IgM和IgG抗體篩查的指定方法，但方法靈敏度尚需進(jìn)一步提高。鑒于靈敏度較高的核酸檢測方法尚無法在醫(yī)院和血站大規(guī)模推廣，因此，提高梅毒螺旋體抗體免疫學(xué)檢測方法的靈敏度具有重要意義。 結(jié)合磁性納米粒子的超順磁性和金表面生物分子可修飾性的

3、雙重特質(zhì)，本課題組研制了Fe3O4/Au磁性復(fù)合微粒，并將其實現(xiàn)了商業(yè)化(金磁微粒GoldMag(R))。本研究以金磁微粒為載體，結(jié)合化學(xué)發(fā)光檢測系統(tǒng)，建立了TP抗體的磁酶免化學(xué)發(fā)光檢測方法。研究內(nèi)容包括4個部分：①TP混合抗原免疫磁珠的制備；②磁分離酶聯(lián)免疫反應(yīng)條件的優(yōu)化；③化學(xué)發(fā)光檢測系統(tǒng)的優(yōu)化；④TP抗體磁酶免化學(xué)發(fā)光法檢測方法的評價。 將重組梅毒螺旋體混合抗原(包括TP47、TP44.5、TP17和TP15)包被在金磁微

4、粒(平均粒徑5μm)表面，在與被檢樣品以及辣根過氧化物酶(HRP)標(biāo)記的混合抗原的雙抗原夾心酶聯(lián)免疫反應(yīng)后，HRP結(jié)合在磁粒表面，然后引入化學(xué)發(fā)光物質(zhì)魯米諾，通過HRP催化魯米諾的化學(xué)發(fā)光強(qiáng)度的讀取實現(xiàn)對樣品中梅毒螺旋體抗體的檢測。結(jié)果表明，TP抗原包被量為5μg/mg，方陣實驗結(jié)果顯示HRP標(biāo)記抗原的最佳工作濃度為1：3000稀釋，選擇免疫學(xué)反應(yīng)的溫育時間為30 min，以1×PBS緩沖液(pH8.0)為化學(xué)發(fā)光緩沖介質(zhì)，魯米諾、過氧

5、化氫及對碘苯酚的濃度分別為1×10-3 mol/L，1×100 mL/L和3×10-3 mol/L，建立了TP陽性血清稀釋倍數(shù)與其相對發(fā)光強(qiáng)度之間的標(biāo)準(zhǔn)曲線，方法具有良好的線性關(guān)系，R2=0.9988。與以酶標(biāo)板為載體測定TP抗體的商品化試劑盒(ELISA法)做了比較，單純以金磁微粒為固相載體的檢測靈敏度可提高2倍，若進(jìn)一步引入化學(xué)發(fā)光檢測系統(tǒng)，其靈敏度可提高16倍。本方法對陽性血清重復(fù)測定11次的結(jié)果顯示，其相對標(biāo)準(zhǔn)偏差(RSD)為5